Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
ного геля агарозы толщиной б мм оснащены специальные мостики, на которых можно вести препаративный электрофорез ДНК в пластинах геля агарозы толщиной до 1 см.
Вместе с тем для работы с микроколичествами препарата описано приготовление гелей для горизонтального электрофореза толщиной 0,1 мм на предметных стеклах. После высушивания такой гель образует настолько тонкую, не заметную глазом пленку, что она позволяет вести авторадиографию даже меченных 3Н препаратов [Amaldi, 1972].
Высоковольтный горизонтальный электрофорез в пластинах ПААГ толщиной 0,5 мм был использован для секвенирования нуклеиновых кислот. Для улучшения теплоотвода гель размером 30 X 50 см, подложив под него тонкую пленку, укладывали на металлический охлаждающий столик самодельного прибора, накрывали еще одной пленкой и плотно, по всей поверхности прижимали к столику давлением наполненной воздухом подушки [Kutateladze et al., 1979].
Глава 3
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
В двух предыдущих разделах были детально описаны практические приемы подготовки и проведения опытов по электрофорезу. Это позволяет приступить к подробному анализу, систематизации и сопоставлению физической сущности и потенциальных возможностей многочисленных и разнообразных вариантов этого метода, развитых за последние годы. В главах 3 и 4 мы попытались представить более или менее целостную картину бурного развития электрофоретических методов исследования белков и нуклеиновых кислот по состоянию на середину 1980 г. Главная задача изложения — выяснение существа и возможностей каждого из рассмотренных ниже вариантов. Однако следует еще раз подчеркнуть абсолютную необходимость совершенного овладения описанной выше техникой эксперимента, без которой попытки реализации самых блестящих замыслов заранее обречены на провал.
Из множества рассмотренных ниже экспериментальных работ в интересах экономии места и концентрации внимания на главном будут взяты только самые существенные количественные данные. Не следует пытаться по ним воспроизвести эти работы — для этого необходимо тщательно изучить цитируемый первоисточник.
Рассмотрению конкретных вариантов в обеих главах предпосланы довольно подробные замечания общего характера, которые постоянно следует иметь в виду при анализе и сопоставлении этих вариантов.
ЗАМЕЧАНИЯ ОБЩЕГО ХАРАКТЕРА Миграция белков в геле
Ранее было показано, что электрофоретическая подвижность биополимеров в геле («') пропорциональна их подвижности в свободной жидкости (ы0), которая определяется отношением суммарного заряда макромолекулы к ее массе. Фактором, обусловливающим отличие и' от и0, является сила трения о гель, которая зависит от соотношения линейных размеров макромолекул и пор геля, а следовательно, от молекулярных масс белков и концентрации ПААГ. Молекулярные массы подавляющего большинства индивидуальных белков не превышают 500 ООО. Поэтому использование гелей агарозы оказывается нецелесообразным, кроме тех случаев, когда разделение белков хотят вести только по величине отношения заряда к массе. Как правило, электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем 5—20% акриламида.
Белки являются цвиттерионами. Их суммарным зарядом, а следовательно и отношением заряда к массе, можно управлять
путём Изменений pH буфера, в которой полимеризуют ПААГ и ведут электрофорез и который далее будем именовать рабочим. Очевидно, чта оптимальное значение pH рабочего буфера обусловливает не максимальный заряд, а максимальное различие зарядов разных белков, составляющих исходную смесь. Поэтому в большинстве случаев нецелесообразно использовать экстремальные величины pH рабочего буфера, слишком удаленные от изоэлектрических точек всех белков смеси. Для обычных кислых белков оптимальные значения pH буфера оказываются в нейтральной или слабощелочной области; миграция белков идет в направлении от катода к аноду. Для щелочных белков (гистонов, белков рибосом и др.) целесообразно использовать слабокислые буферы (pH 4—5). Эти белки различаются по величине суммарного положительного заряда и мигрируют в направлении от анода к катоду.
Несмотря на малое количество фракционируемого белка, от рабочего буфера требуется существенная емкость, так как при образовании зоны локальная концентрация белка может оказаться значительной. Поэтому приходится использовать буферы с концентрацией 0,1—0,2 М и более. При этом следует учитывать, насколько близко к границе буферной области лежит рабочее значение pH. Если такое приближение к границе необходимо, то для обеспечения достаточной буферной емкости моляр-ность буфера приходится еще увеличивать. Вопрос об электропроводности буферов рассмотрен ниже.
Отметим далее, что эффект трения о гель зависит не только от молекулярной массы, но и от конфигурации и жесткости белковой макромолекулы. Глобулярные белки, неспособные к агрегации или диссоциации на субъединицы, ведут себя более или менее одинаково, хотя их размеры зависят от плотности упаковки глобулы. Рыхлые глобулярные и, особенно, фибриллярные белки могут деформироваться при взаимодействии с гелем и тем самым облегчать себе миграцию между его нитями. Этот эффект особенно сильно выражен у высокомолекулярных нуклеиновых кислот.
