Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
3. Профильтруйте среду через миллипоровый фильтр (размер пор 0,45 мкм) и
поместите аликвоты по 25 или 3 мл в пробирки или флаконы, используемые
под культуры. Культуральные сосуды должны отвечать пяти основным
требованиям: они должны быть стерильными; иметь подходящий размер для
закрепления в системе вращения (разд. 6.2); объем позволяющий содержать
еще и газовую фазу, равную 20 мл; герметически закрываться, и, наконец,
эмбрионы не должны к ним прилипать. Учитывая все эти требования, наиболее
подходящими следует считать флаконы из силн-конированного стекла со
стеклянными пробками (не токсичными н скрупулезно очищенными) или
универсальные культуральные пробирки (Sterilin). Чтобы иметь гарантию
герметичности, рекомендуется на пробку наносить слой вакуумной
силиконовой смазки.
4. Выдержите среду на воздухе с 5% С02 при 37 °С в течение нескольких
часов.
5. После переноса эмбрионов следует насытить среду соответствующей
газовой смесью (разд. 6.3), осторожно вдувая газ в течение 1 мин.
Закройте сосуды соответствующими пробками и поместите в роллеры при 37
°С.
ков рекомендуется 100%-ная сыворотка. Способ приготовления крысиной
сыворотки описан в табл. 3.6. Важно учесть следующее: сыворотка должна
быть получена из крови, где фибриновый сгусток образовался в плазме, а не
в цельной крови. Если крови дать свернуться до отделения сыворотки, у
ранних пост-имплантационных эмбрионов крысы чаще наблюдаются аномалии в
развитии и замедленный рост [21J. Ни пол, ни штамм донора, по-видимому,
значения не имеют [18].
Количество среды зависит от стадии и числа эксплантируе-мых эмбрионов, а
также от длительности культивирования. В отношении эмбрионов мыши
систематический анализ не проводился, но по грубой оценке 2,5 мл среды
достаточно для поддержания роста и развития четырех 8-дневных, трех 9-
дневных или двух 10-дневных эмбрионов в течение 24 ч.
Рекомендуется предварительно выдержать среду в течение нескольких часов
или оставить на ночь в увлажненном СОг-ин-кубаторе (5% СОг в воздухе) при
37°С. Это удалит из сыворотки бблыиую часть эфира (см. табл. 3.6) и
уменьшит время насыщения среды С02 вручную. В табл. 3.7 описана процедура
приготовления среды.
6.2. Роллерная система
При культивировании крысиных эмбрионов вращение культуральных сосудов,
обеспечивающее постоянный контакт всей среды с газовой фазой и,
следовательно, постоянное насыщение
Рис. 3.5. Основные детали роллерной культуральной системы. 1. Приводной
шкив. 2. Ось, соединенная с электродвигателем постоянного тока (30
об/мин). 3. Ременная передача, сопряженная с ведомой осью. 4. Ведомый
шкив. 5. Вторая ведомая ось. 6. Зубчатое колесо, закрепленное на второй
ведомой оси. 7. Ведомое зубчатое колесо, закрепленное на оси барабана 8.
Вращающийся барабан (1,25 дюйма, длина 12 дюймов). 9. Пластина, на
которой закреплены
оси барабана.
кислородом, создает условия для нормального развития в течение более
длительного периода, нежели статическая культура [18]. Ранние
постимплантационные эмбрионы мыши развиваются в статической культуре,
если эксплантацию произвели на стадиях первичной полоски, однако
нормальное развитие поддерживается не более 24 ч [22]. Судя по опыту
культивирова- -ния крысиных эмбрионов, можно ожидать, что система
вращения культуральных сосудов улучшит и условия развития эмбрионов мыши
на стадии первичной полоски, хотя сравнения статических и ротационных
культур именно для этой стадии развития мыши не проводилось.
Ротация достигается помещением флаконов или пробирок на параллельные
роллеры или прикреплением флаконов к вращающемуся диску. Чтобы
культуральная среда полностью покрывала эмбрионы, флаконы или роллеры
приподнимают под небольшим углом, вследствие чего среда остается на дне
флакона. Скорость вращения должна быть порядка 30-60 об/мин. Роллерную
установку, заключенную в инкубаторе на 37 °С, можно приобрести у В. Т. С.
Engineering, Кэмбридж, Великобритания. Но несложно сконструировать и
собственную систему роллеров, подходящую к стандартному инкубатору.
Приво-
Эксперименты с постимплантациониыми эмбрионами мыши
Первичная
ролоска
7-й
5% С2
20 С 28 С 35 С
8-й
1 9-й
Дни беременности
95%0.
10-й
11-Й
81
Рис. 3.6. Процентное содержание кислорода, необходимое для развития
эмбрионов разных стадий. С - сомиты.
дящий мотор должен располагаться вне инкубатора, чтобы не нарушать
температурный режим. На рис. 3.5 показан основной принцип устройства
такой системы.
6.3. Газовый режим
По мере развития эмбрионы требуют все большего насыщения среды
кислородом, поэтому для разных стадий развития используют разные газовые
смеси. Эксперименты на крысиных эмбрионах указывают на то, что увеличение
потребности в кислороде объясняется двумя причинами: переходом от
гликоли-
тического способа получения энергии к использованию цикла Кребса и
системы транспорта электронов и необходимостью компенсировать отсутствие
функциональной хориоаллантоисной плаценты (служащей in vivo важнейшим
