Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
1. С помощью микрохирургических инструментов отделите зародышевую область
яйцевого цилиндра (разд. 4.1).
2. Зародышевую часть (рис. 3.3, Б, 1) перенесите в профильтрованный
(Milli-pore, Sartorius, размер пор 0,45 мкм) 0,5%-ный (в/о) трипсин
(BDH), 0,25%-ный (в/о) панкреатин (Difco) в бескальцневом и безмагниевом
солевом растворе Тироде - Рннгера11, pH 7,6-7,7, при 4°С. Инкубируйте при
4°С 10-20 мин.
3. Перенесите зародышевые фракции с минимальным объемом переваривающей
смеси в большой объем РВ12)+10% ЭТС (т. е. 5 мл в 50-мм чашке Петри).
4. Осторожно пипетнруйте эмбрионы, вводя и выталкивая их при помощи
вытянутой, оплавленной снлнконнрованной пипетки, внутренний диаметр
которой несколько меньше, чем зародышевый цилиндр (рис. 3.3, Б, 2).
Каждый раз вводите в пипетку эмбрион тем концом, где прошла плоскость
разреза. При этом энтодерма отслоится от цилиндра.
5. Обычно после удаления энтодермы подлежащая мезодерма уплощается и
выпячивается наподобие двух крыльев, связанных с эпибластом лишь по длине
первичной полоски. Отделите эти крылья разрезами, проходящими как можно
ближе к первичной полоске (рис. 3.3, Б,3). Если мезодер-мальные крылья
после удаления энтодермы не выпячиваются, мезодерму можно отделить или
пипетнрованием, или осторожными прикосновениями игл; она отслоится в
передней и боковых областях.
6. Удалите оставшиеся рыхло лежащие вдоль полоски клетки кончиком нглы
(рис. 3.3, Б, 4). Учитывая природу первичной полоски, нельзя быть
уверенным, что в этой области эмбриона не осталось примеси мезодермальных
клеток, для этого потребовалось бы удалить всю полоску полностью (см.
рис. 3.4).
') Солевой раствор Тироде - Рингера (г/л): NaCI -8, KCI - 0,3, NaHjP04-
5H,0 - 0.093. KIIiPO, - 0,025, NaHCOj - 1, глюкоза - 2.
2) Состав PBl см. в гл. 13, разд. 3.1.1.
эксплантат окружается популяцией выселившихся клеток с адгезионной
поверхностью, которую на основании ряда критериев, в том числе по
содержанию предшественников меланоцитов [13], можно определить как
относительно чистую популяцию клеток нервного гребня. В тех случаях,
когда важно сохранить какие-то черты нормального морфогенеза, фракции
следует инкубировать в суспензионной культуре. Чтобы предотвратить рост
ткани, поверхность чашки рекомендуется заливать 1%-ным раствором агара в
синтетической среде, выбранной для данной культуры [14]. Например,
специфические фракции 8-дневного эмбриона, оставленные связанными с
внезародышевой областью, растут в покрытых агаром чашках с
модифицированной Дульбекко средой Игла (DMEM) +50%-ная крысиная сыворотка
(разд. 6.1). В этих условиях фракции остаются в суспензии и проявляют
интенсивный морфогенез.
76
Глава 3
Рис. 3.4. Срез 8-дневного эпибласта, выделенного с помощью микрохирургии
в сочетании с ферментной обработкой. ПП - первичная полоска.
5.2. Эктопические трансплантации
Разнообразные фракции или ткани постимплантационных эмбрионов мыши будут
продолжать расти и дифференцироваться, если их перенести в хорошо
васкуляризованную область иммунологически подходящего взрослого хозяина
[2J. Использовались и ксеногенные места имплантации, например, хорио-
аллантоис, но для оптимального развития наиболее предпочтительна в
качестве хозяина - сингенная мышь. Несмотря на то, что морфогенез таких
трансплантатов аномален, набор дифференцированных тканей, формирующийся в
этих "экспериментальных тератомах", можно использовать в качестве
критерия гистогенетических потенций трансплантированной ткани. Следует
отметить, что если в трансплантат входит трофэктодерма или внезародышевая
эктодерма, можно ожидать, что геморрагический ответ, спровоцированный
этими тканями, будет маскировать дифференцировку другого типа [15].
Особого интереса заслуживает тот факт, что зародышевая область эмбриона
(до 8 дней беременности), пересаженная под капсулу семенника или почки,
дает начало перевиваемой опухоли [16, 17]. Эта опухоль характеризуется
присутствием клеток эмбриональной карциномы - слабо дифференцированных,
сходных по морфологическим и иным признакам с клетками эпибласта и
примордиальными половыми клетками. Процедура эктопической имплантации под
капсулу семенника описана в табл. 3.5.
Эксперименты с постимплантациониыми эмбрионами мыши
77
Таблица 3.5. Эктопическаи трансплантация под капусу семенника
1. Отделите предназначенную для пересадки область илн ткань и поместите
ее в РВ1')+Ю% ЭТС.
2. Вручную вытяните силиконированную пастеровскую пипетку так, чтобы ее
диаметр был чуть больше размера кусочка ткани. Втяните в пнпетку столбик
парафинового масла, затем пузырек воздуха и после немного РВ1 + 10% ЭТС.
Чтобы парафиновое масло эффективно контролировало уровень жидкости в
пипетке, пузырек воздуха должен находиться в тонкой части пипетки.
3. Анестезируйте снигенного самца (Avertin, 0,1 мл/5г массы тела).
4. Под контролем бинокулярного микроскопа сделайте ножницами поперечный
разрез кожн примерно 0,5 см длиной по средней линии живота над передней
