Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
эмбрионы того же возраста, извлекаемые из самки и используемые для оценки
степени развития. Контроль in vitro: нормальные, растущие в культуре
эмбрионы; служат для оценки роста в условиях культивирования. Меченый
контроль: эмбрионы, меченные той же дозой [3Н]-тимидина, что и донорская
ткань; позволяют контролировать нетоксичность метки, однородность ее
распределения и ожидаемое разведение в процессе культивирования. Химера
in vitro: инъецированный эмбрион. Контроль поглощения: эмбрионы,
фиксированные сразу после периода мечения; позволяют оценить процент
меченых клеток.
а) в парафиновом масле, заполняющем систему, не должно быть пузырьков
воздуха;
б) инструменты должны быть совершенно прямыми, пересекающими
горизонтальное поле зрения микроскопа и лежащими точно параллельно друг
другу.
Рис. 3.8. Основные детали микроманипуляционной установки, используемой
для ннъекцин в эмбрион клеток или метки. 1, 2. Правый н левый
микроманипуляторы, закрепленные на платформе (Leitz). 1-используется с
микроманипуляционной камерой Puliv, которая устанавливается на микроскопе
с фиксированным штативом н выпрямляющей оптикой; 2 - используется для
манипуляций в чашке Петри под стереомикроскопом. 3. Регулятор перемещения
инструментов в вертикальной плоскости ("вертикальный контроль"). 4.
Регулятор наклона инструментов. 5. Регулятор перемещения инструментов в
горизонтальной плоскости ("латеральный контроль"), 6. Регулятор
перемещения вперед. 7. Рычаг управления. 8. Регулятор высоты. 9.
Регулятор угла наклона головкн инструмента. 10. Головка инструмента. 11.
Микрометрический латеральный контроль. 12. Микрометрический контроль
перемещения вперед. 13. Держатель инструмента. 14. Шприц Agla с
микрометром (Wellcome, Derbyshire, UK). 15. Насос де Фонбрюна, сообщающий
системе положительное или отрицательное давление.
86
Глава 3
Таблица 3.9. Установка инструментов
1. Убедитесь в том, что трубки шприца (Agla) и иасоса (de Fonbrune)
заполнены парафиновым маслом, что в них нет пузырьков воздуха и запас
масла в шприце и насосе достаточен.
2. Сияв колпачок и металлический промыватель, введите держатель
инструмента в каждый конец трубки и заполните парафиновым маслом так,
чтобы мениск масла выступал из отверстия держателя.
3. Поместите колпачки и промыватели в нужном положении на инъекционную и
удерживающую пипетки. Введите инъекционную пипетку в инструментальный
держатель, прикрепленный к насосу, убедившись в том, что капилляр
удерживается промывателем. То же проделайте с удерживающей пипеткой,
прикрепив ее к шприцу. Оба инструмента заполните парафиновым маслом.
4. Сфокусируйте микроскоп на каплю среды, в которой будет проводиться
инъекция.
5. Установите держатели так, чтобы инструменты (микропипетки) на
манипуляторе лежали точно один против другого горизонтально и находились
в поле зрения микроскопа. Убедитесь в том, что обе микропипетки после
окончательной установки могут перемещаться по всему полю зрения при
помощи рычага управления, оставаясь постоянно в фокусе.
6. Уберите микропипетки. Если используется манипуляционная камера, микро-
пипетки просто отодвигаются до границы горизонтального контроля; если
используется чашка Петри, удобнее поднять микропипетки из капли среды с
помощью "контроля наклона" манипулятора.
Процедура установки инструментов описана в табл. 3.9 (см. также гл. 12,
разд. 3.2).
В том случае когда вся процедура делается под препаровальным микроскопом
и инъекции проводятся в чашке Петри, важно, чтобы концы инструментов
располагались слегка под углом к дну чашки, иначе плечо пипетки,
образовавшееся при вытягивании капилляра, будет мешать ее отверстию
прикасаться к дну чашки (см. разд. 9). Это достигается благодаря введению
в инструменты двух изгибов (рис. 3.11 Г, 2) и наклону инструментов и
манипулятора, как показано на рис. 3.8. При манипулировании в висячей
капле важно проследить за положением обоих инструментов - они должны быть
параллельны предметному столику микроскопа.
7.2. Приготовление метки или клеток для инъекций
7.2.1. Метка
Недавно было обнаружено, что инъекция агглютинина зародышей пшеницы
(АЭП), связанного с такими метками, как коллоидное золото или пероксидаза
хрена (ПХ), дает эффективное мечение клеток, выстилающих амниотическую
полость [24J. Представляется вероятным, что и другие макромолекулы,
способные связываться с клетками эпибласта или эктодермы,
Эксперименты с постимплантациониыми эмбрионами мыши
87
например другие лектины или антитела (см. гл. 2, разд. 4), могут
обеспечить эффективное избирательное маркирование этих клеток или клеток,
выстилающих иные полости эмбриона. Если перед исследователем стоит задача
пометить только выстилающие клетки, он должен иметь в виду, что к
проникновению метки во внутренние ткани может привести повышение
гидростатического давления в полости. Чтобы избежать этого, следует
приготовить концентрированный раствор метящего вещества и инъецировать
