Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
органом газообмена) [18J. Нужная концентрация кислорода в газовой фазе на
разных стадиях развития представлена на рис. 3.6. На всех стадиях смесь
должна содержать 5% СОг, конечный объем смеси дополняется Ыг. На тех
стадиях, где прослеживаются более длительные сроки (более 24 ч),
рекомендуется повысить процентное содержание кислорода.
6.4. Оценка развития
Очевидно, что ценность любого эксперимента, в том числе и культивирования
эмбрионов, определяется тем, насколько близко к норме происходит
дифференцировка, морфогенез и рост эмбрионов, развивающихся in vitro.
Следовательно, важным условием экспериментальной работы служит выбор
надежного
6-171
62 Глава 3 /¦
.ТИ^|
Таблица 3.8. Некоторые параметры оценки развития культивируемых
эмбрионов
Общая морфология /
Степень осевого поворота
Число пар сомитов
Степень слияния нервных валиков
Состояние аллантоиса (слит или не слит с хорионом)
Присутствие илн отсутствие специфических структур (почек конечностей,
слуховых плакод и пр.)
Относительные размеры разных структур (головы, сомитов и др.)
Гистология
Присутствие, отсутствие и морфология специфических структур Плотность
упаковки клеток Митотический индекс разных тканей Индекс гибели клеток
разных тканей
Рост и метаболизм
Кранио-каудальный размер (или другие удобные измерения физических
размеров)
Содержание белка, измеряемое колориметрическим методом по Лоури [23]
Включение радиоизотопов: [3Н]-тимидина, [35С]-метионииа
Физиология
Присутствие или отсутствие, скорость сердцебиения
Присутствие или отсутствие, степень циркуляции висцерального желточного
мешка
критерия правильности развития. В табл. 3.8 перечислены возможные
параметры. По ним сравнивают культивируемые эмбрионы с эмбрионами того же
возраста, развивающимися in vivo. Кроме того, в любой эксперимент должен
быть включен в качестве стандарта неоперированный контроль.
- 7. Включение клеток или метки в эмбрионы in vitro
Для того чтобы проследить за перемещением поверхностных клеток,
выстилающих полость, их маркируют, вводя соответствующую метку в
эмбриональную полость. Эта методика ценна тем, что дает возможность
изучать судьбу клеток эпибласта, инвагинирующих через первичную полоску
или миграцию клеток нервного гребня [24J. Инъекция других веществ, таких,
как специфические ферменты или их ингибиторы, может использоваться для
оценки значения тех или иных молекул в различных морфогенетических или
дифференцировочных событиях. Инъекция меченых клеток в эмбрион (в
эктопические или ге-
Эксперименты с постнмплантационными эмбрионами мышн
83
теротопические участки) позволяет проследить развитие специфических
тканей или отдельных частей эмбрионов [25, 26]. Общая стратегия получения
"химер" in vitro представлена на рис. 3.7.
Мы не ставили целью описать в этой главе все возможные манипуляции с
постимплантациониыми эмбрионами; ограни-1 чимся простейшей операцией
инъекции клеток в эмбрионы на стадии первичной полоски или ранней
закладки сомитов, для осуществления которой понадобятся всего лишь два
инструмента. Более сложные манипуляции требуют дополнительных
инструментов, таких, как прямые и закругленные иглы [27] или электроды
(например, для инъекции в отдельные клетки in situ маркера - пероксидазы
хрена) [28, 29]. На практике наилучшую комбинацию инструментов для каждой
конкретной операции экспериментатор подбирает сам методом проб и ошибок,
но если он овладел простой методикой наподобие инъекции с двумя
инструментами, принципы изготовления и применения более сложных
инструментов станут для него очевидными.
7.1. Оборудование
Для того чтобы контролировать инъекции растворов, кле-' ток или плотных
тканей, необходим микроманипулятор (Leitz, Wetzlar, ФРГ). Основные
компоненты этой установки представлены на рис. 3.8. Манипуляции с
эмбрионами на стадии первичной полоски или с зародышами более ранних
стадий можно проводить в капле среды, свисающей с силиконированного
покровного стекла, заключенного в камеру микроманипулятора (Leitz),
заполненную парафиновым маслом (детали см. гл. 12, разд. 2.3.1). В этом
случае наиболее приемлем микроскоп с фиксированным штативом, с
выпрямляющей изображение оптикой и длиннофокусными объективами (т. е.
Microtec М2, Microinstruments, Oxford). Манипуляции с эмбрионами более
поздних стадий лучше удаются в капле среды на залитом жидким парафином
дне бактериологической чашки Петри или в крышке от чашки Петри. Здесь
более уместен стандартный препаровальный микроскоп. Таким микроскопом
можно пользоваться и при манипуляциях с эмбрионами на стадии первичной
полоски, но более слабое разрешение делает операции не очень точными.
Самое важное условие удачной микроманипуляции - хорошие инструменты (см.
разд. 9), точно приспособленные для решения конкретной задачи.
7.1.1. Подготовка микроманипупяторов и инструментов
Наиболее важные моменты, которые следует учесть при подготовке:
6"
Меченый контроль
Рис. 3.7. Общая стратегия получения химер in vitro. Контроль in vivo:
