Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
границей селезенки. В том же положении сделайте разрез стен-кн тела.
5. Тонким пинцетом захватите жировую подушку семеиинка н вытяинте его
через отверстие в стенке тела.
6. Заметив первоначальное положение пузырька воздуха в пастеровской
пипетке, втяните в нее трансплантируемую ткань.
7. Удерживая в одной руке пипетку и инъекционную нглу (21-го калибра),
сделайте небольшое отверстие нглой в капсуле семенника и введите в
отверстие кончнк пнпеткн. Скользящим движением углубите пипетку под
капсулу семенника на расстояние около 4 мм.
8. Осторожно выведите трансплантат, слегка извлекая пнпетку. Можно
видеть, как трансплантированная ткань появится иа поверхности семенника.
Если нет, трансплантацию можно проконтролировать положением пузырька
воздуха в пипетке. Он должен переместиться к ее концу, но не давайте ему
выйтн из пипетки в семеииик. Извлеките пнпетку полностью.
9. Возвратите семенник вместе с его жировой подушкой в брюшную полость.
Такую же операцию при необходимости можно проделать с другим,
противолежащим, семенником.
10. Зашейте стенку тела, зашейте или наложите зажнм на кожу.
!) Состав РВ1 см. в гл. 13, разд. 3.1.1.
6. Культивирование целых эмбрионов
Методы культивирования постимплантационных эмбрионов дают возможность
изучать клетки в их нормальном окружении. Вот почему в высшей степени
необходимо иметь в руках надежные н эффективные культуральные системы,
позволяющие поддерживать нормальное развитие эмбрионов в течение
относительно длительного периода. К сожалению, было показано, что мышиный
эмбрион менее толерантен к эксплантации in vitro во время гаструляции и
органогенеза, чем эмбрион крысы [18, 19]. Использование режимов,
поддерживающих почти нормальные рост и развитие эмбрионов крысы в течение
нескольких дней [20], в отношении мышиного эмбриона оказалось значительно
менее успешным. Например, в отличие от крысы развитие эмбриона мыши на
стадии, предшествующей образованию первичной полоски, является in vitro
совершенно непредсказуе-
78
Глава 3
Таблица 3.6. Приготовление крысиной сыворотки
1. Анестезируйте крысу эфиром.
2. Сделайте веитарльиый, по средней линии, разрез кожи и етеики тела.
Извлеките внутренности и отведите их в сторону.
3. Спиииая аорта лежит по средней линии примыкания к полой вене. Из двух
кровеносных сосудов аорта меньше и бледнее. Введите иглу (21-го
калибра/Р/г дюйма) от шприца иа 10 или 20 мл в спинную аорту (скосом вниз
и по направлению к сердцу).
4. Осторожно втяните кровь. Если делать это слишком быстро, может
произойти гемолиз. В зависимости от размера крысы получают от 8 до 15 мл
крови.
5. Осторожно перенесите кровь в центрифужную пробирку. Немедленно от-
центрифугируйте при 1200 g в течение 5-10 мин. Кровяные клетки осядут, и
в слое плазмы сформируется фибриновый сгусток. (На этой стадии
разделенную кровь можно хранить при 4°С 18 ч.)
6. Не касаясь эритроцитов, тонким пинцетом осторожно выньте фибриновый
сгусток. Центрифугируйте при 1200 g в течение 5 мии.
7. Пастеровской пипеткой соберите сыворотку и перенесите в другую
центрифужную пробирку.
8. Центрифугируйте при 1200 g 5 мии. Отберите сыворотку в следующую
пробирку. Приготовьте аликвоты удобного объема (т. е. по 2,5 или 5 мл).
9. Инактивируйте сыворотку нагреванием в водяной бане при 50 °С в течение
30 мии. Слегка приоткройте крышки пробирок для испарения эфира.
10. После охлаждения сыворотки внесите антибиотик (бензилпеиициллии,
100 МЕ/мл; сульфат стрептомицина, 100 мкг/мл). Добавление антибиотика
существенной роли ие играет. Если с сывороткой и средой обращаться
осторожно, загрязнение культуры и в отсутствие антибиотиков происходит
исключительно редко. Храните сыворотку при - 20 °С до 3 месяцев.
мым. И хотя эксплантация эмбрионов с уже сформированной первичной
полоской идет значительно лучше, на сегодняшний день невозможно
поддерживать нормальные рост и развитие мышиного эмбриона в культуре
более 24 или 36 ч. Но даже имеющиеся в нашем распоряжении 24 ч дают очень
много для изучения дифференцировки и морфогенеза, поэтому, несмотря на
существующую неадекватность метода, культивирование целых эмбрионов
остается ценнейшим источником информации о постимплантационном развитии.
Описанная в этом разделе процедура культивирования пост-имплантационных
эмбрионов мыши основана на методах, разработанных для крысиных эмбрионов
[18J. Каждый исследователь вправе усовершенствовать эти методические
приемы. Не следует рассматривать приведенные протоколы опытов как
законченные рекомендации.
6.1. Среды
Эмбрионы, эксплантируемые на 7, 8 или 9-й день беременности, могут расти
в крысиной сыворотке, разбавленной 1 : 1 DMEM (Flow Laboratories). Для
эмбрионов более поздних сро-
Эксперименты с постимплантациониыми эмбрионами мыши
79
Таблица 3.7. Приготовление среды
1. Разморозьте нужный объем среды.
2. Добавьте равный объем DMEM (Flow Laboratories) с глутамином, если
синтетическая среда его не содержит. Перемешайте.
