Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
диссоциируют в этой же среде при помощи пипетки с оплавленным концом и
диаметром чуть меньше кластера диссоциируемых клеток [14].
Другой способ отделения продвинутой в развитии ВКМ заключается в том, что
бластоцисте дают вылупиться из блестящей оболочки, прикрепиться и
образовать трофэктодермальные выросты (см. разд. 3.5.2). Затем при помощи
ротовой пипетки удаляют узелок клеток ВКМ, образовавшийся на верхушке
слоя трофэктодермального выроста.
3.5. Выделение трофэктодермы
Трофэктодерму (ТЭ) трудно отделить от ВКМ, не прибегнув к
микрохирургической методике, предложенной Гарднером
[31]. Однако можно воспользоваться двумя другими способами.
3.5.1. Выделение трофэктодермальных пузырьков или отделение ТЭ от
бластоцчст
ВКМ мышц значительно более чувствительна к летальным повреждениям
рентгеновским облучением или антиметаболнга-ми, чем ТЭ, поэтому многими
из таких воздействии пользуются для получения трофэктодермальных
пузырьков, лишенных ВКМ [28]. Кроме того, бластомеры ранних стадий
дробления, культивируемые после диссоциации поодиночке или небольшими
группами, часто дают начало "ложным бластоцистам", состоящим, по всей
видимости, только из ТЭ [26]. Однако чистота ТЭ, полученной этими
способами, вызывает сомнение.
Другой способ дает клеточные массы трофэктодермального эпителия
мурального района бластоцисты и связан с получением "гигантских"
бластоцист в результате агрегации до 10 мо-рул, как описано в разд. 3.3.
Эти "гигантские" бластоцисты настолько велики, что можно бритвенным
лезвием, скальпелем или острой стеклянной иглой под контролем микроскопа
отделить муральную ТЭ от ВКМ и полярной ТЭ [32]. При переносе в культуру
такие трофэктодермальные массы могут объединяться, разрастаться и
приобретать форму пузырьков ТЭ.
48 Глава 2 /
^ ------------------------------------------------------------
3.5.2. Выделение из трофэктодермальных р/зрастаний
Эмбрионы культивируют до стадии вылупившейся бластоцисты в М16 + БСА
(табл. 2.5) и затем переносят в пластиковые чашки Пегри (Falcon) или на
пластиковые покровные стекла в более сложную среду (т. е. DMHM/, в
которую добавлена инактивированная нагреванием 10%-ная ЭТС, пенициллин
(60 мкг/мл) и стрептомицин (50 мкг/м^).
В течение 24 ч культивирования эмбрионы прикрепляются ко дну
культуральной чашки и на второй день образуют трофэктодермальные выросты,
стелющиеся по субстрату (рис. 2.2, 12). Такие культуры сохраняют
жизнеспособность примерно в течение недели. Смена среды может продлить
этот период. На вершине выроста закладывается ВКМ в виде клеточного
узелка, который удаляют при помощи ротовой пипетки.
Осторожно подбирая субстраты и среды, можно получить и более поздние
постимплантационные стадии развития ([33], см. также гл. 3, разд. 6).
3.6. Подсчет клеток
Число клеток может быть подсчитано прямо, если эмбрионы или клеточные
агрегаты легко диссоциируют. В противном случае ядра клеток эмбрионов или
клеточных агрегатов окрашивают, а затем производят диссоциацию, как
описано ниже.
3.6.1. Окрашивание ядер по Гимза
1. Целые эмбрионы (с блестящей оболочкой или без нее), ВКМ или другие
кластеры клеток поместите в 0,9%-ный раствор цитрата натрия. Инкубируйте
от 1 до 10 мин. В течение этого времени клетки должны округлиться
вследствие ослабления контактов (чем более продвинута стадия развития
эмбриона, тем большим должно быть время действия цитрата натрия).
2. Перенесите эмбрионы или клетки на обработанные ацетоном предметные
стекла, фиксируйте каплей этанол : уксусная кислота (3:1 по объему) и
высушите на воздухе.
3. Профильтруйте краску Гимза (5% в PBS, табл. 2.4) через миллипоровый
фильтр непосредственно перед окрашиванием. Время инкубации препаратов с
красителем - 10 мин до подсчета ядер.
Этот метод не подходит для поздних бластоцист (разд. 3.6.2).
3.6.2. Окрашивание ДАФИ
1. Окрашивайте ядра в флуоресцентном красителе ДАФИ, растворенном в
культуральной среде 100 мкг/мл, в течение 30 мин при 37°С [26].
Эксперименты с предимплаитациоииыми эмбрионами мыши
49
2. Диссоциируйте эмбрионы (вплоть до ранней бластоцисты) или клеточные
агрегаты в бескальциевой среде или в 0,9%-ном цитрате натрия, высушите на
воздухе, фиксируйте 70%-ным этанолом и подсчитывайте ядра в
флуоресцентном микроскопе, снабженном соответствующим источником света и
фильтрами.
Для подсчета ядер ТЭ и ВКМ поздних бластоцист выполните следующие
процедуры.
1. Следуйте иммунохирургической методике (как описано в разд. 3.4) до тех
пор, пока клетки ТЭ не начнут разбухать в комплементе.
2. Тщательно промойте бластоцисты в М2 + БСА (табл. 2.5), инкубируйте в
ДАФИ (100 мкг/мл в М2 + БСА в течение 30 мин при 37 °С), снова промойте,
поместите бластоцисты в маленькую каплю М2 + БСА на обработанное ацетоном
предметное стекло.
3. Отделите ВКМ от ТЭ оплавленной микропипеткой и перенесите в каплю
0,9%-ного цитрата натрия.
4. Дайте ТЭ подсохнуть и через 15 мин частично диссоциируйте ВКМ; дайте
подсохнуть.
