Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 17

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 162 >> Следующая

(пре-зумптивная внутренняя клеточная масса, ВКМ) [26].
Начиная с середины 16-клеточной стадии, эмбрионы все труднее поддаются
диссоциации из-за формирования фокальных плотных контактов и адгезионных
контактов между наружными клетками. Эти контакты не так чувствительны к
бес-кальциевой среде, поэтому для диссоциации эмбрионов поздних стадий
применяются методы более жесткие и не всегда совместимые с длительным
выживанием диссоциированных клеток. Например, инкубация в течение 15 мин
при 37 °С в 25 мг/мл трипсина и 10 мг/мл ЭДТА в бескальциевой М2 + 6
мг/мл БСА, сопровождаемая интенсивным пипетированием, достаточна для
диссоциации 16-клеточных эмбрионов и бластоцист [13, 25]. Для поздних
бластоцист используют предварительную инкубацию в цитохалазине Д,
разрушающем микрофиламенты (ЦХД 0,5 мкг/мл при 37°С в течение 10 мин).
Этот препарат, вызывая округление клеток и ослабевание межклеточной
адгезии, повышает чувствительность к воздействию раствором тринси-
на/ЭДТА. Успешная диссоциация бластоцист зависит от полного удаления ЦХД
перед воздействием трипсином.
Диссоциация изолированных ВКМ описана в разд. 3.4.
3.3. Агрегация эмбрионов и изолированных клеток
Одним из методов создания химерных (или "аллофенных") мышей служит
агрегация двух или более генотипически различающихся морул и
реимплантацня получившегося эмбриона в матку псевдобеременной приемной
матери ([23], см. также гл. 6, разд. 2.2). Для получения агрегата два или
более 8- или 16-клеточных эмбрионов без блестящей оболочки культивируют
вместе, подталкивая их друг к другу до тех пор, пока они не слипнутся.
Адгезии способствует инкубация во время контакта в лектине -
фитогемагглютинине (ФГА, исходный раствор Gibco 1 : 20).
В некоторых экспериментах требуется агрегация индивидуальных, парных
клеток или групп синхронно или асинхронно делящихся клеток. Чтобы
получить такие агрегаты, нужно воспользоваться присущей бластомерам
"липкостью" и просто с помощью пипетки привести их в контакт друг с
другом в теплой (37°С) М2 + БСА в культуральной чашке на нагревательном
столике микроскопа. Для стимуляции адгезии можно в среду добавить ФГА. Он
не вызывает дефектов развития, но
46
Глава 2
----------------------------------------------7---------------
может способствовать нужной ориентации клёток при их адгезии [12]. 1-2-
минутная экспозиция ФГА прд 37°С в М2 + БСА обычно достаточна для
стимуляции адгезии?, после чего клетки можно отмыть от лектина,
сполоснуть и чистой пипеткой перенести в маленькие капли Ml6+БСА.
Инкубировать под маслом при 37 °С в атмосфере с 5% С02, где они будут
агрегировать. Анализ морфологии образовавшихся клеточных кластеров (чему
способствует окрашивание ядер 4,6-диамидино-2-фенилин-долом (ДАФИ), разд.
3.6.2) используется для изучения влияния межклеточных взаимодействий на
судьбу клетки в ходе развития [26].
3.4. Выделение внутренних клеток морул или внутренних клеточных масс
бластоцист
Многочисленные способы выделения кластеров жизнеспособных внутренних
клеток морулы (>16 клеток) или бластоцисты (>32 клеток) основаны на
применении цитотоксических реагентов, повреждающих слой наружных клеток,
но не проникающих к внутренним (благодаря плотным контактам, которые
создают барьер проницаемости). Чаще всего для этого используют
цитотоксические антитела, связанные с комплементом (иммунохирургический
способ), но пригоден и ионофорез.
Иммунохирургическая процедура основана на методе, впервые описанном
Солтером и Ноулсом [27, 28].
1. Эмбрионы с блестящей оболочкой или без нее инкубируйте в теплой (37
°С) кроличьей антимышиной сыворотке (инактивированной нагреванием при
56°С в течение 30 мин и разбавленной 1 : 10 средой М2), 2-4 мин (морулы и
ранние бластоцисты) или 10 мин (поздние бластоцисты).
2. Трижды промойте эмбрионы переносом через теплую М2+БСА (табл. 2.5),
затем инкубируйте 5-7 мин с комплементом в разведении от 1 : 5 до 1 : 10
солевым раствором, забуференным фосфатом (PBS). Источник комплемента -
сыворотка крови; большое значение имеет тип сыворотки. Наименее токсична
сыворотка крысы [29], но можно пользоваться и сывороткой морской свинки.
Безусловно токсична сыворотка кролика. Комплемент адсорбируйте агарозой
[30]. Его следует хранить при -70°С, размораживать только перед
употреблением.
3. После инкубации в хомплементе перенесите эмбрионы в свежую М2 и
оставьте их в ней на 20-30 мин при 37°С; в течение этого времени можно
наблюдать, как на наружных клетках появляются пузыревидные вздутия и
начинается их лизис.
Эксперименты с предимплантацнонными эмбрионами мыши
47
4. Пипетируя эмбрионы микропипеткой с оплавленным концом и внутренним
диаметром чуть больше внутренней клеточной массы (ВКМ), удалите наружные
клетки.
Чтобы диссоциировать внутренние клетки или ВКМ, следует вначале
разрыхлить агрегаты, для чего их инкубируют 20 мин в теплой бескальциевой
среде М2 + БСА или М2+БСА, содержащей 0,5 мкг/мл ЦХД. Затем клетки
Предыдущая << 1 .. 11 12 13 14 15 16 < 17 > 18 19 20 21 22 23 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed