Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
NaCl 0,80
КС1 0,02
СаС12 или (СаС12-2Н20) 0,02(0,0265)
MgCl2-6H20 0,01
D-глюкоза 0,10
PVP 0,40
Приготовление
Доведите pH до 2,6 при помощи 1 М НС1 (только Analar-HCl). Профильтруйте
раствор через миллипоровый фильтр и храните аликвотами в 1 мл при 4 °С.
Используйте в те* чение 2 суток.
быть достаточными для сортировки и синхронизации эмбрионов, однако точный
анализ механизмов развития требует синхронизации материала на клеточном
уровне. Один из способов получения клеток известного возраста заключается
в диссоциации эмбриона на отдельные клетки, наблюдении за культурами этих
клеток (как описано в разд. 3.1) ив отборе тех из них, которые
разделились в определенном временном интервале. Эта процедура требует
владения навыками снятия блестящей оболочки и методикой диссоциации
клеток.
ЗЛ.1. Уданение бнестящей обоночки (zona pellucida)
Блестящую оболочку можно удалить механически, но при работе с большим
числом эмбрионов лучше использовать для этой цели химические воздействия.
Наиболее часто применяют два реактива - подкисленный раствор Тироде [22]
и раствор проназы [23]. В обоих случаях успех операции определяется
составом и осмолярностью, поэтому рекомендуется испытать действие
реактива на небольшом числе эмбрионов, прежде чем обрабатывать всю
партию.
1. Перенесите эмбрионы небольшими группами в теплый (37 °С) кислый
раствор Тироде (табл. 2.3) или раствор проназы (табл. 2.4). Температура
(37 °С)-наиболее важное условие успешного удаления оболочки в растворе
Тироде.
2. Осторожно втягивая н выталкивая эмбрионы через пипетку, контролируйте
изменение поверхности под микроскопом. В кислом Тироде процесс идет
быстро - в течение секунд блестящая оболочка сжимается и истончается.
Рекомендуется до ее полного растворения перенести эмбрионы в теплую М2 +
БСА (табл. 2.5). Передержка эмбрионов в среде с низким pH приводит к
лизису некоторых, а то и всех клеток. Ранние стадии (вплоть до ранней 4-
клеточной) более чувствительны к кислому Тироде
Таблица 2.4. Реактивы
Реактив
Фирма-поставщик
Приготовление
Хранение
Вода
(Analar) '> Гормоны: ГСЖК
чХГ
Бычий сывороточный альбумин (БСА)2) (кристаллизованный и лнофилизиро-
ваниый) Эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС)2)
Масло (легкое, бесцветное, жидкое, парафиновое)
Пируват (натриевая соль) кристаллический, тип II Лактат (натриевая соль)
60%-вый сироп Стрептомицина сульфат Беизилпеиициллии (Ciystapen)
Поливинилпирро-литон
BDH Ltd Poole, Dorset,
UK lntervet PO Box 5830AA, Boxmeer,
The Netherlands
Та же, что и для
ГСЖК
Sigma Chemical Co.
Fancy Road, Poole, Dorset BH17 7NH UK Cat No. A4378 Flow Labs Ltd,
PO Box 17, Second Avenue Industrial Estate Irvine, Ayrshire KA12 8NB, UK
BDH Ltd Product No. 29436
Sigma Chemical Co., Cat No. P2256
Sigma Chemical Co., Cat No. L1375 Glaxo Labs, Ltd Ltd BDH Ltd
1 флакон (1000 ME) развести до 20 мл 0,9%-ным стерильным солевым
раствором (50 МЕ/мл)
1 флакон (1500 ME) раз бавить до 30 мл 0,9%-ным стерильным солевым
раствором (50 МЕ/мл)
Хранить при - 20 "С. Размо розить, инактиви ровать нагрева иием при 56 °С
в течение 30 мин
Автоклавировать 20-30 мин при 0,8 атм, остудить, профильтровать через
фильтровальную бумагу (Whatman)
Хранить при -20 °С аликвоты по 5 мл. Размораживать при +4°С. Препарат
негоден после недельного хранения при +4°С
Как ГСЖК
Хранить сухим при + 4 °С
Хранить при - 20 °С аликвоы по 10 мл
Хранить при комнатной температуре или при 37 °С для использования в
культуральных чашках Хранить сухим при +4°С
Хранить при + 4 °С
42
Глава 2
Продолжение табл. 2.4.
Реактив
Фг!рма-поставщик
Приготовление
Хранение
Феноловый
ный
крас-
Солевой раствор, забуференнын фосфатом (PBS), таблетки (Dulbecco А)
Проиаза (для удаления блестящей оболочки)
Гналуронидаза, тип II из семенников овцы (для удаления клеток кумулюса)
HEPES
DMEM (MED)
(для разрастания трофэктодер-мы)
BDH Ltd
Oxoid Ltd, UK
Calbiochem - Behring Corp , PO Box 22, Bishops Stort-lord Herts CM22 7RQ,
UK
Sigma Chemical Co. Cat No. H2126
Sigma Chemical ¦ Co. Cat No.
H3375 Flow Labs Ltd
Растворить 0,13 г в 10 мл изотонического NaHC03 Растворить 1 таблетку в
100 мл бидистиллиро-ванной воды. Автоклавировать Приготовить 5%-ный
раствор проназы в PBS. Добавить PVP (конечная концентрация 10 мг/мл).
Хорошо размешать и отцентрифугиро-вать
Растворить 20 г гиалуронидазы и 0,2 г PVP в 20 мл PBS
Прибавить L-глу-тамин 20 мг/мл; пенициллин 60 мкг/мл, стрептомицин 50
мкг/мл и инактивированную нагреванием 10%-ную ЭТС
Хранить при +4°С
Хранить при +4°С
Стерилизовать фильтрованием. Приготовить аликвоты супернатанта и хранить
при -20 °С
Профильтровать через миллипоро-вый фильтр и хранить аликвоты в 1 мл при -
20 °С.
Хранить при +4 °С
') Высокая степень очнсткн может быть необходима для культивирования
челове-ческих эмбрионов (см. гл. 14, разд. 4.3).
2) Приобретайте большую партию лишь после проверки образца на
токсичность.
(особенно в начале клеточного цикла), чем поздние. Одноклеточные эмбрионы
