Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
стрелкой), но по мере развития они сливаются в одну. Эмбрионы, у которых
этого не происходит, должны быть отброшены. 10. Ранние бластоцисты.
Указаны ВКМ и ТЭ. Отбросьте все эмбрионы без отчетливо выраженной ВКМ.
11. Различные морфологические картины вылупляющихся бластоцист. 12.
Эмбриональные разрастания в виде неправильных выростов ТЭ с узелком ВКМ.
38
Глава 2
тоциста вылупляется (рис. 2.2,11), прикрепляется к эпителию матки и
начинает имплантироваться. На этой стадии эмбрионы уже не вымываются.
Поэтому целесообразно собрать бластоцисты заблаговременно и наблюдать их
дальнейшее развитие in vitro в простой синтетической солевой среде (т. е.
Ml6 +БСА, табл. 2.5) или дать им вылупиться и культивировать в более
сложной среде, т. е. в среде Игла, модифицированной Дуль-бекко (DMEM) с
10-ной эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), см. разд. 3.5.2.
Бластоцисты извлекают следующим образом.
1. Отсеките каждый рог матки от подлежащего мезентерия и отрежьте в
местах соединения матки с трубой и ее шейки с влагалищем. Поместите
каждый рог на фильтровальную бумагу, увлажненную М2+БСА (табл. 2.5), и
удалите лишнюю кровь.
2. Введите инъекционную иглу 25-го калибра, соединенную со шприцем, в
просвет рога матки со стороны яичника и промойте 0,2-0,5 мл М2 + БСА. Эту
процедуру делайте в пластиковой чашке Петри или в стеклянной камере, без
применения микроскопа.
3. Соберите бластоцисты в теплую (37 °С) М2 + БСА, промойте в теплых и
сбалансированных СОг каплях М16 + + БСА (табл. 2.5) и инкубируйте в
М16+БСА под маслом при 37 °С в атмосфере с 5% 'СОг.
4. Бластоцисты сформируются, вылупятся и прилипнут к соответствующим
образом покрытой поверхности пластиковой чашки Петри (т. е. типа Falcon),
однако в среде М16+БСА они как следует не прикрепятся и роста троф-
эктодермы не будет. Для последующего развития нужна более сложная среда,
содержащая сыворотку (т. е. DMEM+10% ЭТС); см. разд. 3.5.2.
3. Манипуляции с эмбрионами и клетками
3.1. Сортировка эмбрионов по стадиям
Клеточные и молекулярные события предимплантационного развития
осуществляются в строгой последовательности. О временном их контроле
известно очень мало, однако можно предположить существование по меньшей
мере двух "часов": один из них - сам клеточный цикл [2]. Анализ
механизмов временного контроля требует синхронизированной популяции
клеток и эмбрионов.
Как уже обсуждалось в разд. 2.1.1, популяция эмбрионов, полученная в
результате осеменения in vivo, будет гетерогенной. поэтому время после
инъекции чХГ и время, прошедшее с
Эксперименты с предимплантационными эмбрионами мыши___________39
момента оплодотворения, не могут быть признаны адекватными критериями
начала развития. Более разумно выбрать морфологический критерий,
анализировать культуры через определенные промежутки времени (например,
30 минут или каждый час) и отбирать те эмбрионы, которые в выделенный
интервал времени достигли данной стадии. Таким образом можно отобрать
группы эмбрионов с одинаковым темпом развития. Стадии, которые приведены
ниже, хорошо различаются в интакт-ных эмбрионах и могут быть использованы
в качестве критерия синхронизации (последовательность прохождения стадий
см. табл. 2.1).
1. Дробление (рис. 2.1, 11-21). Число клеток легко подсчитать вплоть до
стадии компактизации (8 клеток), затем клеточные границы перестают быть
четкими. Оплодотворение in vitro способствует синхронности дробления до
2-клеточной стадии, однако внутренняя гетерогенность времени дробления,
вероятно, обусловливает десинхронизацию каждого следующего деления
дробления.
2. Компактизация (рис. 2.1, 21, 22, рис. 2.2, 1-4). Процесс уплощения
клеток обычно происходит через 3,5-7,5 ч после начала 8-клеточной стадии
(4-клеточный цикл). Его можно считать удобной отправной точкой для
определения последовательности стадий развития; при некоторой тренировке
компактизация выявляется вполне объективно.
3. Деление, приводящее к 16-клеточной стадии (конец 4-го и начало 5-го
цикла) (рис. 2.2, 5, 6). Эта стадия характеризуется декомпактизацией
перед митозом и рекомпакти-зацией по завершении деления. Регулярные
наблюдения над поздними 8-клеточными эмбрионами дают, таким образом,
возможность выявить субпопуляцию новообразованных 16-клеточных эмбрионов.
4. Формирование бластоцеля (6-й клеточный цикл) (рис. 2.2, 9, 10).
Наиболее раннее свидетельство транспорта жидкости можно заметить на 32-
клеточной стадии (табл. 2.1), когда образуется наполненная жидкостью
вакуоль (иногда две вакуоли, которые увеличиваются и затем сливаются).
Следовательно, отбор по этому признаку даст популяцию эмбрионов, начавших
формировать бластоцель и проходящих свой шестой клеточный цикл.
3.2. Сортировка изолированных клеток по стадиям
Дробление - процесс асинхронный, и по мере продвижения
предимплантационного развития степень асинхронности возрастает.
Морфологические критерии, описанные в разд. 3.1, могут
40
Глава 2
Таблица 2.3. Состав кислого раствора Тироде (г/100 мл) [22]
