Биология развития млекопитающих - Манк М.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка):
меченого антитела и лектина) или двуступенчатым (или "непрямым").
Используются два взаимодействующих реактива (обычно антитела), из которых
первое меченое, а второе немеченое. Интернализацию и другие формы
перераспределения метки можно предотвратить включением 0,02%-ного азида
натрия либо в разведения антисыворотки, либо в промывающую и заключающую
среды. Та же цель достигается при фиксации клеток в 3,7%-ном формалине в
PBS (глутаральдегидная фиксация вызывает автофлуоресценцию клеток). После
фиксации клетки следует тщательно отмыть. Важно помнить, однако, что
после воздействия азидом натрия и фиксации клетки уже не жизнеспособны.
1. Прямое меченые
а) нефиксированные эмбрионы или клетки инкубируйте при комнатной
температуре 15-30 мин в маленьких каплях
4*
52
Глава 2
ФИТЦ- или родамин-конъюгированного лектина пли антитела. Нужные
разведения антитела (в М2, см. табл.
2.5) необходимо определить экспериментально. Используется цельная
сыворотка и фракции IgG [125]. Конкана-валин А (КонА) - наиболее
распространенный лектин - применяется в концентрациях 0,5-1,0 мг/мл в М2
+ БСА (рис. 2.2,5);
б) промойте эмбрионы в нескольких каплях среды М2 + БСА (феноловый
красный не следует использовать из-за его флуоресценции). Клетки и
эмбрионы можно наблюдать прижизненно или фиксировать немедленно после
окрашивания;
в) для заключения эмбрионов наиболее удобны предметные стекла,
применяемые для типирования (разд. 5). Каждое стекло поместите в
контейнер адекватной глубины и погрузите в жидкое парафиновое масло.
Расположите контейнер со стеклом под бинокулярным микроскопом и с помощью
пипетки введите под парафиновое масло в центр каждого углубления
небольшой объем М2 + БСА. В эти капли поместите небольшие группы меченых
эмбрионов. Уменьшите объем капли, снимите стекло с масла, слегка
подсушите и закройте покровным стеклом. Уберите избыток масла и изучайте
препарат под флуоресцентным микроскопом, снабженным источником и
фильтрами, соответствующими использованным флуорох-ромам.
2. Непрямая иммунофлуоресценция
Препарат обработайте первичным немеченым антителом, продолжайте в
соответствии с пп. "а" и "б" (см. выше). Затем инкубируйте эмбрионы при
комнатной температуре 15-20 мин со вторым антителом (т. е. наслоите ФИТЦ-
или родамин-конъюгированное антитело или IgG, связывающийся с первым
антителом), соответственно разбавленным М2. После этого следуют пп. "б" и
"в".
4.1.2. Сканирующая электронная микроскопия
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) применяется для изучения
морфологии клеточной поверхности (рис. 2.2, 7 и [4]), а также для
топографического распределения мембранных детерминант, выявленных
иммунохимически [42]. Связывающиеся с поверхностью лиганды можно
комбинировать с видимым маркером (например, Staphylococcus aureus,
который присоединяется к Fc-части некоторых иммуноглобулинов через свой
компонент-белок А [42, 43].
Эксперименты с предимплантациоиными эмбрионами мыши___________33
Основные процедуры СЭМ - те же, что используются при работе с объектами
большого размера; специфические детали, разработанные для микроскопии
эмбрионов или составляющих их клеток, приведены ниже. В ходе работы
объекты приклеиваются к покровным стеклам, поэтому нужно принять все меры
предосторожности против пыли и других загрязняющих частиц, для чего
непосредственно перед употреблением следует фильтровать все растворы
(Millipore, размер пор 0,22 мкм) [41].
1. У покровных стекол (удобный размер 9X9 мм) пометьте сторону, несущую
эмбрионы. Очистите стекла, погрузив их в 100%-ный спирт, промакните
бумагой без ворсинок и высушивайте на воздухе не менее 1 ч. Погрузите
чистые покровные стекла в свежеприготовленный и профильтрованный раствор
поли-Ь-лизииа (PLL, Sigma, тип lb, 1 мг/мл в бидистиллированной воде)
примерно на 1 ч. Непосредственно перед употреблением дважды или трижды
сполосните покровные стекла в 0,1 М какодилатном буфере pH 7,4 и
поместите их в индивидуальные лунки пластиковых культуральных плат
(Nunc), содержащие 0,1 М какодилатный буфер pH 7,4.
2. Фиксируйте эмбрионы с удаленной блестящей оболочкой или бластомеры в
6%-ном глут ар альдегиде (Sigma) на 0,1 М какодилатном буфере с pH 7,4 в
течение 1 ч при комнатной температуре.
3. Поместите эмбрионы в 1%-ный глутаральдегид на 0,1 М какодилатном
буфере pH 7,4 и перенесите их с помощью пипетки в центр приготовленного
покровного стекла. Платы с лунками хорошо устанавливаются на предметном
столике бинокулярного микроскопа, и если сделать изогнутую пипетку, всю
процедуру можно проводить под контролем микроскопа. Применение 1%-ного
глутаральде-гида способствует плотному прикреплению клеток к поверхности
покровного стекла, обработанной поли-Ь-лизи-ном. Не прикасайтесь к
клеткам концом пипетки и не давайте им прикасаться друг к другу, иначе
будет невозможно отделить их, не повредив.
4. Немедленно обезводьте препараты проведением через спирты возрастающей
крепости, профильтрованные через миллипоровые фильтры непосредственно
