Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Манк М. -> "Биология развития млекопитающих " -> 23

Биология развития млекопитающих - Манк М.

Манк М. Биология развития млекопитающих — М.: Мир, 1990. — 406 c.
ISBN 5-03-001333-4
Скачать (прямая ссылка): biologiyarazvitiyamlekopitaushih1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 17 18 19 20 21 22 < 23 > 24 25 26 27 28 29 .. 162 >> Следующая

возможность пометить выделенные бластомеры и проследить их судьбу после
реагрегации с немечеными клетками, можно произвести мечение наружных
клеток интактного эмбриона, начиная с 16-клеточной стадии.
Процедура мечения эмбрионов флуоресцирующими микрочастицами заключается в
следующем.
1. Эмбрионы, освобожденные от блестящей оболочки, или клетки инкубируйте
в разведении 1 : 50 маточной суспензии микрочастиц в М2 + БСА (табл. 2.5)
в течение 5- 15 мин при 37 °С, промойте их переносом через 2-3 капли М2 +
БСА, после чего их можно анализировать немедленно или агрегировать с
другими немечеными бластомерами (см. разд. 3.3) и продолжать
культивирование. При необходимости произведите диссоциацию, как описано в
разд. 3.2.2.
2. Внутриклеточное мечение микрочастицами латекса, покрытыми
флуоресцеином, можно проводить до или после поверхностного мечения
родамин-конъюгированным КонА (Polysciences). Инкубирование эмбрионов или
клеток в ТРИТЦ-КонА при 1 мг/мл в М2 + БСА позволит идентифицировать
наружные клетки эмбриона со снятой оболочкой (1 мин для 16-клеточного
эмбриона, 5 мин для бластоцисты при 37 °С) или определить полярность
изолированных клеток (5 мин, 37 °С). После инкубации промойте эмбрионы
или клетки, сменив 2-3 капли М2 +
+ БСА.
3. Для анализа флуоресценции клетки или эмбрионы фиксируйте в 4%-ном
формалине в PBS 10 мин, затем промойте в М2 + БСА и заключите их в этой
среде в лунках стекла для тканетипирования (разд. 4.1.1). Для изучения
препаратов используйте флуоресцентный фотомикроскоп и фотопленку Kodak
Tri-X 35 мм.
4. Положение и судьбу меченных флуоресцеинлатексом клеток в бластоцисте
определите тремя способами:
а) анализируйте весь эмбрион целиком;
Эксперименты с предимплантационными эмбрионами мыши___________59
б) поверхность интактного эмбриона пометьте ТРИТЦ-КонА (в качестве
маркера трофэктодермы), диссоциируйте бластоцисту (см. разд. 3.2.2),
фиксируйте клетки (4%-ным формалином 10 мин) и выясните паттерн мечения
клеток ФИТЦ и (или) ТРИТЦ;
в) сделайте ультратонкие срезы для анализа в ПЭМ JB-4 (Polysciance),
оптимальная заключающая среда - водорастворимая смола (детали
соответствующей методики см. в работе [13J).
5. Реактивы, среды и оборудование
5.1. Реактивы
Используйте лучшие из имеющихся у вас реактивов. Пользуйтесь набором
шпателей только для реактивов тканевой культуры, следите за тем, чтобы
после каждого употребления они были тщательно вымыты.
В табл. 2.4 приводится список реактивов, которые мы можем рекомендовать
на основании опыта нашей лаборатории.
5.2. Среды
В табл. 2.5 описаны те среды, которые мы с успехом используем в своей
работе. При извлечении эмбрионов и переносе их из инкубатора применяем
среду М2 с буфером HEPES (pH 7.4 при 37 °С) [52]. Для культивирования
наиболее эффективна забуференная СОг среда М16 [53]. Обе среды
модифицированы в соответствии с указаниями Гудэла и Маро [54] и получены
из исходных растворов, приведенных в табл. 2.5. Осмолярность М2 и М16
находится в пределах 285- 290 мОсмоль. Для культивирования бластоцист
используем DMEM +10% ЭТС.
5.3. Оборудование
5.3.1. Стеклянная посуда
Для приготовления сред необходимо иметь специальный набор стеклянной
посуды, который сразу же после использования споласкивается
бидистиллированной водой, моется только в бидистиллированной воде и
высушивается в сушильном шкафу.
5.3.2. Микроскопы
Важно, чтобы для манипуляций с эмбрионами и их культивирования была
отведена специальная комната. Рекомендуется кондиционер воздуха для
поддержания нормальной комнатной
Таблица 2.6. Возможные затруднения при экспериментировании
Вероятные причины
Способы устранения
Проблема: суперовуляция не удается или яйца дегенерируют в яйцеводе
Возьмите более молодых мышей (3-4-иед)
1. Самки слишком стары
2. Гормоны иекачествеииые
Сделайте свежие растворы Купите новые препараты гормонов
Проблема: после спаривания яйца остаются неоплодотворенными
3. Самцы неплодовиты
4. Овуляция и спаривание ие синхронизированы
Замените самцов-производителей Проконтролируйте длительность светового
дня в виварии. (Спаривание происходит в середине темного периода, обычно
длящегося с 19.00 до 7.00.) Используйте мышей в состоянии проэструса
(3,5-4-иед). Не инъецируйте чХГ ранее 14.00
Проблема: яйца или эмбрионы лизируют вскоре после их помещения в среду
5. Осмоляриость неправильна (эмбрионы разбухают или сморщиваются)
6. Грязные стекла с лунками
7. Стерилизующие фильтры, шприцы и другая пластиковая посуда,
использованная для приготовления сред, токсична
8. Среды и (или) масло токсичны
9. Летучие растворители
Проверьте осмоляриость и, если нужно, приготовьте свежие среды
Попробуйте пластиковые Инкубируйте среды в контакте с соответствующим
материалом и затем проверьте жизнеспособность эмбрионов Проверьте БСА и
масло (см. [14]) Проверьте, ие пользовались ли недавно краской или
растворителями в помещении Манипуляции с эмбрионами проведите в другом
месте и проверьте их жизнеспособность
Предыдущая << 1 .. 17 18 19 20 21 22 < 23 > 24 25 26 27 28 29 .. 162 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed