Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
131
тота ИЛ-3 только за счет одного этапа обратнофазовой хроматографии на колонке С-18 с элюцией ТФК-ацетонитрилом (pH 2) увеличивалась в 265 раз. Даже при очистке кислотолабильного -у-интерферона на последнем этапе применяли обратнофазовую хроматографию с элюцией градиентом диоксана (0,5 М ацетат аммония, pH 7). Образцы сохраняли активность только после удаления диоксана. Биологически активные препараты получали также при обратнофазовой хроматографии опиоидных пептидов и белков-предшественников (Stein, Uden-friend, 1984).
С использованием обычных носителей и матриц для ВЖХ была проведена частичная очистка МГФР из 7 л среды, кондиционированной клетками WEHI-3B (D-) (Roitsch, Iscove, 1982) (табл. 6-2). Неочищенный исходный материал для хроматографии получали концентрированием на мембране Н1Р10-10 (Amicon). После двух этапов обычной ионообменной хроматографии, обратнофазового и гель-проникающего разделений на носителях для ВЖХ был достигнут выход 27% по активности, связанной с 3,1 мкг белка. Последующая очистка этого материала производилась обратнофазовой хроматографией с тройной системой растворителей (разд. V) или хроматографией на гидроксиапатите (разд. IV, Б).
Д. Препаративное разделение
Небольшие количества высокоочищенных белков, о которых шла речь выше, получали на так называемых аналитических колонках, однако эту же процедуру можно проводить и в препаративных масштабах. В случае ИЛ-2 из 50 г исходного материала было получено 3,5 мкг белка, что дает степень очистки 505 000 (Stern et al., 1984). Что касается ИЛ-3, то из 72 г исходного материала было выделено 3,36 мкг этого белка, т. е. степень очистки составила 1,8-10® (Ihle et al., 1982). Успешное применение ВЖХ для аналитических разделений способствовало развитию более крупномасштабных вариантов фракционирования. В настоящее время большинство матриц доступно в виде готовых полупрепаративных колонок. Дальнейшее совершенствование препаративных колонок сделает возможным разделение методами ВЖХ граммовых количеств белка.
Литература
Alfredson Т. V., Wehr С. Т., Tallman L., Klink F. (1982). J. Liq. Chromatogr., 5,
489—524.
Alvarez V. L., Roitsch C. A., Henriksetx O. (1981). In: Immunological Methods
(I. Lefkovits and B. Pernis, eds.), Vol. II, pp. 83—103, Academic Press, New
York.
Bennett H. P. J., Browne C. A., Solomon S. (1980). J. Liq. Chromatogr., 3, 1353—
1365.
9*
132 Глава 6
Benson Е. R., Hare P. E. (1975). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 619—622.
Corbel С .(1983). Doctoral dissertation, Universite Paris-Nord.
Dorfman P. (1984). Genet. Eng. News, May—June, 15—17.
Fagg B„ Roitsch C. A. (1985). J. Cell. Physiol., submitted.
Fausnaugh J. L., Pfannkoch E., Gupta S., Regnier F. E. (1984). Anal. Biochem., 137, 464—472.
Gooding D. L„ Schmuck M. N.. Gooding К. M. (1984). J. Chromatogr., 296, 107—114.
Gorbunoff M. J., Timasheff S. N. (1984). Anal. Biochem., 136, 440—445.
Gupta S., Pfannkoch E., Regnier F. E. (1983). Anal. Biochem., 128, 196—201.
Hunkapiller М., Kent S., Caruthers M„ Dreyer W., Firca J., Giffin C., Horvath S., Hunkapiller Т., Tempst P., Hood L. (1984). Nature (London), 310, 105— 111.
Ihle I. N.. Keller J., Henderson L., Klein F., Palaszynski E. (1982). J. Immunol., 129, 2431—2436.
Iscove N. N. (1985). In: Leukemia: Dahlem Konf. (I. L. Weissman, ed.) pp. 5— 20. Springer-Verlag, Heidelberg.
Iscove N. N.. Roitsch C. A., Williams N.. Guilbert L. J. (1982). J. Cell. Physiol. Suppl., 1, 65—78.
Jandera P., Churacek J., Colin H. (1981). J. Chromatogr., 214, 35—46.
Juarez-Salinas H., Engelhorn S. C., Bigbee W. L., Lowry M. A., Stanker L. H. (1984). BioTechniques, May—June, 164—169.
Kato Y., Kitamura Т., Hashimoto T. (1983). J. Chromatogr., 266, 49—54.
Kock A., Luger T. A. (1984). J. Chromatogr., 296, 293—300.
Kopaciewicz W., Regnier F. E. (1983). Anal. Biochem., 133, 251—259.
Menge U., Kula M.-R. (1984). Enzyme Microb. Technol., 6, 101—112.
Monch W., Dehnen W. (1978). J. Chromatogr., 147, 415—418.
Pearson J. D., Regnier F. E. (1983). J. Liq. Chromatogr., 6, 497—510.
Pearson J. D., Lin N. Т., Regnier F. E. (1982). Anal. Biochem., 124, 217— 230.
Peterson G. L. (1983). In: Methods in Enzymology (С. H. W. Hirs and Serge N. Timasheff, eds.), Vol. 91, pp. 91—119. Academic Press, New York.
Pfannkoch E„ Lu К. C„ Regnier F. E., Barth H. G. (1980). J. Chromatogr. Set., 18, 430—441.
Regnier F. E. (1983). In: Methods in Enzymology (С. H. W. Hirs and Serge N. Timasheff, eds.), Vol. 91, P. 1, pp. 137—190. Academic Press, New York.
Regnier F. E., Noel R. (1976). J. Chromatogr. Sci., 14, 316—320.
Richey J. (1982). Am. Lab. October.
Righetti P. G.. Tudor G., Ek K. (1981). J. Chromatogr., 220, 115—194.
Rinderknecht E., O’Connor В. H., Rodriguez H. (1984). J. Biol Chem 259 6790—6797.
Roitsch C. A., Iscove N. N. (1982). Int. Symp. HPLC Proteins, Peptides Polynucleotides, 2-nd, Dec. 6—8, Baltimore Abstr. No. 311.
Rubinstein M„ Rubinstein S., Familletti P. C., Miller R. S., Waldman A A Pestka S. (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 76, 640—644.
