Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Б. Реагенты и условия элюции
1. Система 1
Колонка: 4,6X250 мм 10 мкм Vydac ТР201 (300 А, С-18) (Vydac — зарегистрированная торговая марка фирмы The Separations Group, Калифорния, США)
Подвижная фаза: растворитель А: 0,1%-ная трифторуксу-сная кислота (ТФК; Sequanal grade, Pierce); растворитель Б: 1-пропанол (puriss, Fluka, Базель, Швейцария)
Элюция: линейный градиент растворителя Б (0—40%),
30 мин
Скорость потока: 0,8 мл/мин Выявление: по поглощению при 280 и 205 нм Стандарты: апротинин, БСА, карбоангидраза Б, апомиогло-бин и овальбумин (фирмы-изготовители приведены в разд. III, Б) и инсулин (Fluka, Базель, Швейцария) вносили в колонку для контрольного разделения в день постановки опыта
8*
116 Глава 6
2. Система 2
Колонка: та же, что и в системе 1
Подвижная фаза: растворитель А: 10 мМ гептафторбутано-вая кислота (ГФБК; Sequanal grade; Pierce); растворитель Б: 1-пропанол
Элюция: линейный градиент растворителя Б (25—55%), 30 мин
Скорость потока: 0,8 мл/мин
Выявление: по поглощению при 280 и 205 нм
Стандарты: те же, что и в системе 1
3. Система 3
Колонка: 4,6x100 мкм Aquapore RP300 (300 А, С-8), патрон СОЗ-МР, (Aquapore — зарегистрированная торговая марка фирмы Brownlee Labs, Inc., Санта-Клара, США)
Подвижная фаза: растворитель А: 10 мМ ГФБК; растворитель Б: 10 мМ ГФБК в ацетонитриле (для УФ-анализа, Fisons); растворитель В: 10 мМ ГФБК в 1-пропаноле
Элюция: одновременные линейные градиенты растворителя Б (20—55%) и растворителя В (10—25%), 30 мин Скорость потока: 0,8 мл/мин Выявление: по поглощению при 280 нм Стандарты: те же, что и в системе 1
4. Система 4
Колонка: та же, что и в системе 1
Подвижная фаза: растворитель А: 12 мМ НС1 (Ultrex grade, Baker); растворитель Б: 2-пропанол (для ВЖХ, Fisons)
Элюция: линейный градиент растворителя Б (29—34%), 10 мин
Скорость потока: 0,8 мл/мин
Выявление: по поглощению при 280 и 205 н.м
Стандарт: карбоангидраза Б
5. Система 5
Колонка: та же, что и в системе 1
Подвижная фаза: растворитель А: 0,1%-ная ТФК; растворитель Б: ацетонитрил
Элюция: линейный градиент растворителя Б (35—60%), 10 мин
Скорость потока: 0,8 мл/мин
Выявление: по поглощению при 280 и 205 нм
Стандарт: карбоангидраза Б
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
117
6. Система 6
Колонка: та же, что и в системе 3
Подвижная фаза: растворитель А: 0,1%-ная ТФК; растворитель Б: 0,1%-ная ТФК в ацетонитриле
Элюция: линейный градиент растворителя Б (0—70%),
30 мин
Скорость потока: 0,8 мл/мин
Выявление: по поглощению при 280 и 205 им
Стандарты: те же, что и в системе 1
7. Примечания
а. Растворители. Органические растворители использовали без дополнительной очистки. Если при разделении использовали высокочувствительное детектирование по оптическому поглощению, то в системе 3 применяли 1-пропанол (sequanal grade, Pierce). Водные растворы готовили, разводя НС1, ТФК или ГФБК дистиллированной водой, которую пропускали через патрон NORGANIC (Millipore) и фильтровали через фильтр GSWP (размер пор 0,22 мкм) (Millipore).
Для достижения хорошего разрешения при хроматографии в системах 1, 2, 4 и 5 подкисление органического компонента подвижной фазы не является строго обязательным. Однако при доведении концентрации кислоты в органическом растворителе до того же значения, что и в водной фазе, часто получают более острые пики. Кроме того, при этом сводится к минимуму понижение уровня базовой линии и не происходит нежелательных изменений pH.
б. Колонки. Перед нанесением биологически активных образцов колонки многократно промывали соответствующим градиентным раствором до полной стабилизации базовой линии. После каждого разделения колонки промывали до достижения базового уровня и хранили в 1-пропаноле.
в. Выход белка. От 50 нг до 2 мг карбоангидразы Б в 12 мМ НС1 (10 мг/мл) вносили в колонку 10 мкм Vydac ТР201. Аликвоты объемом 10—200 мкл вносили, отбирая образцы шприцем, содержащим 5—20 мкл 12 мМ НС1. При использовании системы 4 получали от 2 мкг до 2 мг белка. В системе 5 с колонки удавалось снять от 50 нг до 50 мкг белка.
г. Сбор фракций. При разделении эритропоэтина (разд. V, В,2) фракции по 10 капель собирали в полиэтиленовые пробирки (Falcon) размером 12X75 мм, содержащие по 400 мкл нейтрализующего буфера (82,6 мМ трис-НС1, pH 8,0;
0,32 М NaCl; 0,1%-ный ПЭГ 6000, pH 7). Фракции перед тестированием фильтровали через фильтр (Millipore) с размером пор
Мв Глава 6
0,22 мкм. Для очистки КСФ и ИЛ-2 (разд. V, В, 3) фракции по
0.5 мл собирали в полиэтиленовые пробирки размером 17х X100 мм (Falcon), содержащие по 1,5 мл модифицированной Исковом среды Дульбекко, pH 7 (МСИДИ). Перед тестированием биологической активности фракции фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
В. Использование обратнофазовой хроматографии
1. Стандарты
Во многих лабораториях признано полезным использование при обратнофазовой хроматографии теста на разделение стандартной смеси белков. При разделении смеси шести стандартных белков в системе 1 (рис. 6-4,Л) проверяется не только разрешение колонки, но и работа системы насосов и градиент-смесителя. Степень разрешения апомиоглобина и карбоангидра-зы Б человека в этой тест-смеси является важным параметром, характеризующим как работу колонки, так и селективность системы колонка — подвижная фаза для белков, более гидрофобных, чем БСА.
