Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Хроматография иммуноглобулинов
135
фировании небольших молекул органических веществ длина цепей пришитых групп оказывает существенное влияние на характер разделения, в то время как фракционирование белков от нее не зависит (Pearson et al., 1982).
В качестве подвижной фазы используют полярный растворитель. Элюция при обратнофазовой хроматографии, как правило, не изократическая. Обычно для элюции используют линейный градиент, увеличивая содержание неполярного органического растворителя в подвижной фазе. В результате полярность растворителя снижается, что и приводит к изменению равновесного распределения молекул между стационарной и подвижной фазами. Этим обеспечиваются селективность элюции и разделение веществ в зависимости от их гидрофобных свойств. При ОФХ первыми элюируются менее гидрофобные вещества.
При ионообменной хроматографии разделение достигается за счет связывания веществ с заряженными группами матрицы. Это связывание, благодаря которому вещество распределяется между подвижной и неподвижной фазами, может затем изменяться при изменении ионной силы или pH. На практике вещества сорбируют на колонке при низких концентрациях солей и элюируют буферными растворами, содержащими высокие концентрации солей. Элюция при этом происходит в основном благодаря ослаблению связывания веществ с матрицей за счет противоионов. Хроматография на гидроксиапатите — матрице на основе фосфата кальция — является комбинацией анионо- и катионообменной хроматографии (Bernardi, 1971; Gorbunoff, Ti-masheff, 1984). Основную роль в разделении играют адсорбционные взаимодействия с ионами кальция, но имеют значение также вторичные, более слабые взаимодействия с фосфатными ионами.
Эти противоположные взаимодействия позволяют получать прекрасное разделение фракций при хроматографии на гидроксиапатите. Абсорбция вещества на гидроксиапатите в существенной степени зависит от вторичной и третичной структур его молекул. При этом элюция также определяется структурой молекул, и, следовательно, можно разделить вещества, фракционирование которых другими хроматографическими методами неэффективно.
Все описанные выше варианты хроматографических методов доступны и для техники ВЖХ. Эта техника получила название «высокоэффективная» благодаря достигнутым высоким скоростям и хорошему разрешению разделений. Данные преимущества обусловлены высоким числом теоретических тарелок (М), характерным для ВЖХ-колонок. Величина N характеризует ширину пика, которую можно получить при элюции с колонки модельного вещества. Очевидно, N определяет разрешение, ко-
136 Глава 7
торое может быть достигнуто при использовании данной колонки. Чем больше число теоретических тарелок, тем выше разрешение. В идеальных условиях N прямо пропорционально длине колонки L и может быть определено по формуле N=L/H. Величина Н — высота одной теоретической тарелки — определяет высоту носителя, обеспечивающую разделение заданной эффективности. Величина Н дает возможность сравнивать колонки и эффективность их использования для модельных веществ. Как и следовало ожидать, колонки для ВЖХ характеризуются чрезвычайно малыми величинами Н. Разделяющая способность колонок для ВЖХ зависит от размера и пористости частиц матрицы в колонках. Чем меньше размер частиц, тем меньше значение Н и тем выше разрешение. Однако, чтобы сохранить скорость потока подвижной фазы при уменьшении размера частиц, требуется повышение давления, причем с увеличением скорости потока подвижной фазы такое повышение должно возрастать. Использование пористых частиц позволяет снизить давление подачи элюента, но при этом одновременно снизится эффективность колонки. В общем между степенью пористости носителя и эффективностью фракционирования можно найти оптимальное соотношение, при котором достигается эффективное и быстрое разделение. Более подробно эти факторы обсуждают Снайдер и Керклэнд (Snyder, Kirkland, 1979).
Б. Практика
Как было отмечено выше, для ВЖХ белков разработаны новые типы матриц, которые позволили устранить многие негативные факторы при хроматографии. Первой существенной модификацией, которая привела к значительным положительным эффектам, было улучшение покрытия матриц требуемым адсорбирующим компонентом, например алкильными группами в случае ОФ-ВЖХ, а также блокировка остальных свободных си-ланольных групп низкомолекулярными модифицирующими алкильными группами. Эту модификацию называют еще блокировкой концов. Большинство матриц для ВЖХ делают на основе силикагеля или органических полимеров. В случае сили-кагельных носителей большие трудности возникали из-за веществ, которые практически необратимо связывались со свободными силанольными группами, не заблокированными после пришивки алкильных групп. Вероятность такого связывания особенно велика для белков. Их десорбция при последующих разделениях может приводить к загрязнению препаратов. Благодаря усовершенствованию методов модификации матриц и модификации свободных силанольных групп негативное влияние
Хроматография иммуноглобулинов
137
неспецифической адсорбции на матрицах для ВЖХ было значительно уменьшено.
