Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Хроматография иммуноглобулинов
143
2. Очистка легких
и тяжелых цепей иммуноглобулинов мыши
После восстановления и алкилирования препараты иммуноглобулинов мыши диализовали против 1 М пропионовой кислоты и 4,5 гуанидинхлорида (Schwarz Mann). Элюцию проводили тем же буфером, охлажденным во льду. Все остальные процедуры проводили так же, как в случае иммуноглобулинов кролика.
В. Обратнофазовая ВЖХ (ОФ-ВЖХ)
1. Общие замечания
Обратнофазовая хроматография (ОФ-ВЖХ) исключительно эффективна при разделении пептидов после расщепления иммуноглобулинов (рис. 7-4). Мы использовали этот метод для
Рис. 7-4. Пептидное картирование моноклональных антител арс CRI+ 10К44-7А1 с использованием ОФ-ВЖХ. Хроматографировали триптический гидролизат антител (0,2 мл, 1 мг/мл), модифицированных я-гидроксифеннлглноксалем. После внесения образца в 0,1%-ной ТФК проводили изократическую элюцию в течение 10 мин, а затем элюцию линейным градиентом ацетонитрнла (0— 80%) с 0,1%-ной ТФК в течение 30 мин. Стрелкой указан пнк, который появляется только при модификации в отсутствие гаптена (Henson, Alkan, 1985).
очистки пептидов, отвечающих за связывание с антигеном, и (или) входящих в состав идиотипических сайтов антител. По пептидному картированию с помощью ВЖХ существует обширная литература. Обратнофазовые матрицы для ВЖХ чаще всего готовят на основе силикагеля. В качестве покрывающих групп обычно используют С8- или С 18-группы, а в качестве исходного
144 Глава 7
компонента подвижной фазы — различные растворители (раствор А). Чаще других применяют трифторуксусную кислоту (ТФК) в концентрации 0,1—1%. При повышении концентрации ТФК разрешение улучшается за счет ион-парного взаимодействия (Regnier, 1983). Однако при этом возникают проблемы при детектировании, так как ТФК имеет относительно высокое поглощение в УФ-диапазоне. При концентрации ТФК
0,5% измерения при 214 нм уже невозможны.
Элюцию производят неполярным растворителем (раствор Б). Обычно предпочитают использовать ацетонитрил, так как он не поглощает УФ-свет и обладает низкой вязкостью. Как правило, ион-парный реагент ТФК добавляют к растворителю Б в той же концентрации, в которой он содержится в растворе А (исходная подвижная фаза). ТФК в концентрации 0,1% обеспечивает хорошее разрешение, а также возможность детектирования белка при 214 нм.
С помощью ОФ-ВЖХ пытались разделять целые молекулы иммуноглобулинов (Alvarez et al., 1981; Henson, неопубликованные данные), однако удовлетворительных результатов получить не удалось, поскольку с колонки элюировался широкий пик с плохим разрешением. Вместе с тем такой результат может быть хорошим показателем неполного расщепления антител. Иммуноглобулины чрезвычайно устойчивы к действию про-теаз. Для того чтобы прошло полное расщепление иммуноглобулинов, полезно предварительно обрабатывать их кислотой. Предполагают, что обработка кислотой вызывает разворачивание структуры иммуноглобулинов, и это способствует протеаз-ному расщеплению.
2. Пептидное картирование иммуноглобулинов
Препараты иммуноглобулинов (1,5 мг) диализовали против
0,1 М NH4HCO3 (Merck) и лиофильно высушивали. Затем к ним добавляли 0,1 н. НС1 (Baker), инкубировали в течение 0,5 ч„ высушивали и добавляли ТРСК-обработанный трипсин (Millipore) в 0,1 М NH4HCO3. Расщепление проводили при 37 °С в течение 16 ч при соотношении трипсин : белок= 1 :40.
Расщепленный иммуноглобулин лиофилизовали, а затем растворяли в 0,1%-ной ТФХ (Pierce) до концентрации 1 мг/мл.
Хроматографию проводили на колонке MPLC Aquapore (С8) RP-300 (Brownlee) с предварительной колонкой RP-300. Образец (0,1—1 мг) вводили с помощью инжектора U6K (Waters). Разделение проводили на хроматографе модели 8800LC (du Pont) при 45 °С. Использовали детектор — модель 440 (Waters Associates)—с длиной волн 280 и 214 нм. Профиль элюции регистрировали на самописце W и W314 Datasyn. Фракции
Хроматография иммуноглобулинов
145-
собирали с помощью коллектора Redirac (LK.B). Выделенные пептидные фракции высушивали на Savant Speed-Vac, растворяли в 0,1%-ной ТФК и рехроматографировали для проверки чистоты. Элюцию проводили растянутым градиентом, который получали, снижая скорость роста концентрации растворителя Б (ацетонитрил в 0,1%-ной ТФК) до 1% в минуту. Описание обычного градиента такой элюции дано в подписи к рис. 7-4.
Г. ВЖХ на гидроксиапатите (ГА-ВЖХ)
1. Общие замечания
Недавно появилось сообщение о том, что ГА-ВЖХ можно использовать для одноэтапной очистки моноклональных антител из асцитных жидкостей (Juarez-Salinas et al., 1984). Мышиные иммуноглобулины IgGi и IgG2 связывали на колонке ГА-ВЖХ и элюировали градиентом фосфатного буфера. Мягкие условия выделения, высокая емкость колонок (20—100 мг) и быстрота выделения делают этот метод весьма перспективным для очистки моноклональных антител. Очистка крысиных моноклональных антител вызывает определенные затруднения,, так как эти антитела не связываются с белком A (Rousseaux et al., 1981). При использовании аффинной хроматографии (на колонках с белком А или другими лигандами) для выделения моноклональных антител возникают трудности, обусловленные десорбцией лигандов с матрицы колонки (что может помешать в дальнейших клеточных исследованиях), а также достаточно жесткой обработкой, необходимой в некоторых случаях для элюции антител с аффинных колонок.
