Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Время, мин
Рис. 6-7. Элюция ИЛ-2 и КСФ с колонки 10 мкм Aquapore RP300 н процессе обратиофазовой хроматографии с применением тройной системы растворителей. 100 мл среды, кондиционированной Т-клеточиой гибридомой (BWXV3) 25-7-D4 (Corbel, 1983), концентрировали до объема 1 мл и наносили непосредственно на колонку для обратнофазовой хроматографии, уравновешенную, как описано для системы 3 в тексте (разд. V,B). Фракции элюата тестировали на активность КСФ (кружки) и ИЛ-2 (квадратики) в присутствии rf-a-метилмаи-нозида.
что цепи, содержащие более восьми углеродных атомов, могут складываться, и при этом белки способны в достаточной степени взаимодействовать только с экспонированной наружу частью цепи (Pearson, Regnier, 1983). Необходимость использования растворителей с низкими pH обусловлена присутствием на силикагельных матрицах остаточных силанолов (Bennett et al., 1980).
2. Растворители
Для элюирования материала с колонок при обратнофазовой хроматографии использовали большое число различных водных подвижных фаз или элюентов на основе органических растворителей. Свойства многих из них обсуждаются в обзоре Ренье
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
123
(Regnier, 1983). Во многих случаях приемлемыми системами для элюции оказались градиентные растворы ацетонитрила, содержащие ион-парный агент ТФК в концентрации 0,1%. ТФК является сильной кислотой и помимо этого обладает целым рядом преимуществ: 1) хорошо солюбилизирует белки; 2) относительно слабо поглощает в УФ-области; 3) доступна в очищенном виде; 4) легко удаляется при лиофилизации. Ацетонитрил обладает теми же достоинствами в отношении поглощения, чистоты и летучести и, кроме того, имеет очень низкую вязкость. При разделении белков используются также такие растворители, как 1- и 2-пропанол, несмотря на их более высокую, чем у ацетонитрила, вязкость. Они обладают большей гид-рофобностью, и поэтому в их присутствии белки можно элюировать при меньших концентрациях органических растворителей.
Д. Препаративное выделение
Подобно ионообменным колонкам для ВЖХ, колонки для обратнофазовой хроматографии характеризуются высокими емкостями в отношении белка при использовании одних и тех же силикагельных матриц (Regnier, 1983). Обычно на аналитическую колонку для обратнофазовой хроматографии размером 4,6 X 250 мм наносят максимум 2—5 мг белка. Однако для белков, сильно отличающихся друг от друга по гидрофобности, таких, как, например, БСА и овальбумин, хорошего разделения достигают и при нагрузках более 10 мг (Regnier, 1983). Для крупномасштабных разделений с использованием обратнофазовой хроматографии у фирм-изготовителей можно приобрести в больших количествах матрицы или уже готовые полупрепара-тивные колонки.
VI. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА И ПРЕДЕЛЫ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
А. Введение
Количество белка при ВЖХ на колонках чаще всего определяют по площади соответствующих пиков элюции, полученных при измерении поглощения при 280 или 205 нм. Для этих целей можно использовать автоматический интегратор, однако его применение не обязательно. Количественную информацию можно получить и с помощью интегрирования профиля элюции на ленте самописца.
Поглощение белков при длине волны 280 нм обусловлено поглощением света в ультрафиолетовой области аминокислотами триптофаном, тирозином и фенилаланином. Для большинства
*24 Глава 6
белков основной вклад в поглощение света вносит триптофан. Поглощение белков при 205 нм связано прежде всего с амидными группами, в том числе с группами пептидных связей. Хотя в этом диапазоне поглощает и гистидин, поглощение при 205 нм не в столь большой степени зависит от аминокислотного состава белков, как поглощение при 280 нм. Поэтому поглощение при 205 нм дает более надежную информацию содержаний суммарного белка. К сожалению, многие органические растворители обладают значительным поглощением в этой УФ-обла-сти. В связи с этим увеличивается фон поглощения, что ограничивает возможности измерений в области коротковолнового ультрафиолета.
Б. Реагенты и условия элюции
1. Калибровочная кривая для поглощения при 280 нм
Для определения площади пиков при регистрации по поглощению при 280 нм калибровочные кривые получали, используя белки, имеющие средний коэффициент экстинкции E0,i%2s01cM = = 1,03 в 12 мМ НС1 (для бычьего сывороточного альбумина
0,60, апомиоглобина 0,95, апротинина 1,27, карбоангидразы Б 1,38, инсулина 0,94). На обратнофазовых колонках, применяя системы 3 и 4 [модифицированный градиент растворителя Б (0—60%), 30 мин] или 6 (разд. V, Б), можно фракционировать от 500 нг до 100 мкг белка.
2. Калибровочная кривая для поглощения при 205 нм
Для получения калибровочных кривых при 205 нм белки в количестве от 50 нг до 10 мкг со средним коэффициентом экстинкции Е0,1%205 1 CM"=29,8 в 12 мМ НС1 (для тироглобулина 28,1, БСА 29,7, овальбумина 32,1, карбоангидразы Б 30,8 и миогло-бина 28,3) элюировали с обратнофазовой колонки и тандемно расположенных колонок (60 см) TSK G3000 SW и TSK G2000 SW, разделяющих по размеру молекул. Условия элюции с обратнофазовых колонок те же, что и при получении калибровочных кривых при 280 нм (разд. VI, Б, 1). Условия элюции для колонок, разделяющих по размеру, описаны в разд. III, Б.
