Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
129
преципитации и затем проводят несколько обычных хроматографических процедур, в результате которых количество белка снижается до миллиграммового уровня. После 4—5 стадий выделения выход активного вещества редко достигает 35%, обычно он не превышает 10%.
Б. Некоторые необоснованные представления
Тот факт, что иногда вещество, выделяемое в слишком малых для детектирования оптическими методами количествах, можно хроматографировать благодаря наличию у него биологической активности, часто приводит к двум неверным предпосылкам. Считают, что 1) если удается определить активность и ее распределение строго локально, то этой активности будет соответствовать одиночный пик белка, и 2) если удается выделить одиночный пик активного белка, то можно определить его аминокислотную последовательность. Однако эти ожидания редко реализуются на практике. Например, для детектирования белка по поглощению в ультрафиолетовой области необходимо 50 нг активного белка (разд. VI). Даже если удается получить белковый пик такой интенсивности, это не означает, что количества белка достаточно для анализа состава и последовательности аминокислот (Shively, 1985). Известно, что при использовании газовых анализаторов удается получить определенную информацию, имея 5 пмоль белка, однако в большинстве микрометодов для секвенирования требуется не менее 50—500 пмоль (Hunkapiller et al., 1984), т. е. 1,5—15 мкг для белка с мол. массой 30 000. Получение даже минимального количества препарата белка для секвенирования с чистотой 80—90% может оказаться весьма непростой задачей, если в исходном веществе концентрация белка составляет несколько пикомолей.
В. Работа с образцом
Концентрирование разбавленных образцов часто приводит к значительным потерям белка. Большие объемы разбавленного материала могут быть эффективно сконцентрированы с применением обратнофазовых колонок, на которые можно наносить образцы объемом от микролитров до литров без потери разрешения при разделении. Если нельзя избежать этапа концентрирования с помощью ультрафильтрации, то лучше всего использовать фильтры серии YM (AMicon), применение которых способствует увеличению выхода белка.
Считают, что к высокоочищенным образцам полезно добавлять буферы, содержащие ПЭГ (0,05%). Правда, к концентрированию образцов, содержащих ПЭГ 6000, следует подходить с
9—1278
130 Глава 6
осторожностью, так как на ультрафильтрах YM-10 ПЭГ также концентрируется и может вызвать преципитацию образца, если его содержание превысит 1%. Повышению выхода белка способствует также применение полиэтиленовой посуды и наконечников для пипеток.
Г. Применение
Как и при обычной хроматографии, гель-проникающие, ионообменные и гидроксиапатитные колонки обеспечивают наиболее щадящие условия при ВЖХ. Вместе с тем не следует пренебрегать и обратнофазовой хроматографией, для которой характерны несколько более жесткие условия элюции. Высокое разрешение и универсальность, присущие этому методу, позволяют использовать его в условиях, когда неприменимы обычные хроматографические методы.
Схемы очистки активного интерлейкина 2 (ИЛ-2) (Stern et al., 1984), интерлейкина 3 (ИЛ-3) (Ihle et al., 1982) и у-интер-
Таблица 6-2. Схема очистки МГФР
Этап очистки Белок, мг Активность, Удельная Выход Степень
стимулирую активность, активного очистки
щая грану- ед./мг белка, %
лоциты, мак
рофаги, эрит
роциты, ед.
Неочищенный концентри 589 24 800 42,1 100 I
рованный материал 293 8 000 27,3 32 0,65
Карбоксиметил-сефароза
ДЭАЭ-сефароза 3,11 5 770 1860 23 44,1
ВЖХ на колонке VYDAC 0,161 16 700 104 000 67 2 470
ТР201, С-18 0,0362 7 420 205 000 30 4 870
ВЖХ на последовательно
расположенных ко 0,0142 11 700 824 000 47 19600
лонках TSK G3000
SW и G2000 SW
ВЖХ на колонке VYDAC
ТР201, С-18:
суммарная актив
ность 0,00311 6 650 2 140000 27 50 800
основной пик
ферона (Rinderknecht et al., 1984) включают как минимум один этап обратнофазовой хроматографии, причем в разных случаях эти этапы могут значительно различаться по типу используемых растворителей и значений pH. В схему очистки ИЛ-2 входят последовательно три этапа обратнофазовой хроматографии: на носителях С-8, С-18 и дифениловом носителе с элюцией буферным раствором ацетат — пиридин— 1-пропанол, pH 4. Чис-
