Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
(1%1)
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ)
127
с ошибками, которые по опубликованным данным присущи трем обычно используемым методам определения белка: биуре-товому методу, методу Лоури и методу Бредфорда. Для этих трех методов ошибки определений устанавливали, сравнивая опубликованные данные (Инструкция по определению белка фирмы Bio-Rad, с. 3—4) с количествами белков, определяемыми гравиметрически. В качестве стандартов для определения по Лоури и Бредфорду использовали бычий у-глобулин, а для определения биуретовым методом — БСА. Несмотря на некоторые различия в определениях при двух длинах волн, диапазон ошибок (средний уровень отклонений) для определений по площади пиков при 205 нм укладывается в диапазон ошибок для трех стандартных колориметрических определений. Петерсон (Peterson, 1983) в своем обзоре указывает, что измерение по поглощению при 205 нм в два раза чувствительнее, чем модифицированный фенольный метод Фолина при определении белка по Лоури.
Интегрирование кривых поглощения при 280 нм является несколько менее надежным методом количественного определения белка из-за значительных вариаций коэффициентов экстинкции белков при этой длине волны. Если исключить из рассмотрения данные для лизоцима, который имеет исключительно высокий коэффициент экстинкции при 280 нм, среднее значение отклонений для измерений при 280 нм снизится до 38%, что укладывается в среднее значение ошибок (в процентах) для трех колориметрических тестов. Тем не менее наиболее точным методом количественного определения белков при ВЖХ следует признать регистрацию поглощения при 205 нм. Определение площади пиков на профилях, полученных при длине волны 280 нм, можно использовать при больших количествах наносимого белка или в тех случаях, когда применяются растворители, имеющие высокое поглощение при 205 нм.
Для того чтобы использовать преимущества, которые дает примерно в 30 раз большая чувствительность измерений при 205 нм (благодаря различиям в средних коэффициентах экстинкции: Е280 1 CMo,i% = 1 и Е205 1 CMo.i %=30), необходимо применять подходящую систему растворителей (например, водные, изократические растворители или градиент низких концентраций ацетонитрила). Кроме того, для повышения чувствительности можно использовать проточную измерительную ячейку с большей чем 1 см длиной оптического пути. В наших экспериментах детектор UVIKON LC 720 был снабжен проточной ячейкой с длиной оптического пути 1,5 см. Как и следовало ожидать, оптическая плотность при 205 нм при концентрации белка 1 мг/мл, была в 45 раз больше, чем оптическая плотность при 280 нм в ячейке с длиной оптического пути 1 см.
128 Глава 6
С особенной осторожностью следует подходить к регистрации поглощения при разделении методами ВЖХ очень малых количеств белка. При этом либо из-за растворителя, либо из-за примесей может повышаться уровень базовой линии или могут появляться артефактные пики. Результаты определения площади пиков следует корректировать путем вычитания всех возможных компонентов сигнала от растворителя, которые выявляются в тщательно проводимых контрольных экспериментах (например, при предварительных прогонах элюирующих градиентов или при нанесении на колонку только компонентов буфера, в котором содержится образец). Хотя детектирование при 205 нм может быть в 30 раз чувствительнее, чем при 280 нм, реальное превышение чувствительности часто составляет не более 10 раз из-за плохого соотношения сигнала и фона. В этом случае увеличение оптического пути кюветы не дает преимуществ, так как увеличивается и сигнал, и фон. Для того чтобы свести к минимуму эти неблагоприятные эффекты, необходимо использовать растворители и другие ингредиенты максимально возможной чистоты. Кроме того, в тех случаях, когда при разделении идет речь о сигналах, близких к предельной чувствительности детектора, рекомендуется использовать для очистки воды такие системы, как патрон NORGANIC. Еще большего уменьшения нежелательных эффектов можно добиться, пропуская растворители перед употреблением через матрицу для обратнофазовой хроматографии.
VII. ОЧИСТКА БЕЛКОВ
А. Предварительные замечания
Разработка эффективной схемы очистки для биологически активного соединения с использованием ВЖХ или обычных методов требует информации о хроматографических параметрах соединения и его взаимодействии с сорбентами. Необходимо также заранее определить требуемое количество и степень очистки конечного продукта. После того как эти вопросы решены, можно оценить необходимое количество исходного материала на основе: 1) специфической активности исходного вещества, 2) концентрации активного компонента в нем и 3) информации
о выходе биологически активного компонента на каждом этапе процесса очистки.
Исходное вещество зачастую содержит более 10 г белка. Аналитические колонки для ВЖХ имеют емкость от 2 до 50 мг, поэтому перед хроматографией необходимо уменьшить количество белка. Обычно на начальных стадиях выделения исходное вещество концентрируют с помощью ультрафильтрации или
