Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
концентрациях.
УЛ ЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
243
Концентрация, мг/мл Концентрация, мг/мл
А Б
РИС. 11.12. Зависимость коэффициента седиментации от концентрации. А.
Результаты седиментационных измерений для трех видов макромолекул: ДНК с
мол. массой - 3 ¦ 106, бычьего сывороточного альбумина (БСА) и
глицерофосфатдегидрогеназы (ГФДГ) (Tanford, 1961; Van Holde, 1971). Б.
Данные по седиментации в относительных единицах для некоторых других
молекул. Обратите внимание на то, что зависимость от концентрации
усиливается по мере увеличения молекулярной массы, которая у ДНК
бактериофага Т7, например, равна 2,5- 107. (Freifelder, D., 1976.
Physical Biochemistry, p. 285. San Francisco, W.H.Freeman and Company.)
Физическое обоснование этих двух равенств также весьма неодинаково. Такой
вид зависимости, как в уравнении (11.41), следует ожидать в том случае,
когда основным следствием изменения концентрации растворенного вещества
является изменение фрикционных свойств раствора. Коэффициент седиментации
прямо пропорционален/-а/ прямо пропорционален вязкости раствора. Как
показано в гл. 12, 17 всегда можно представить в виде степенного ряда по
концентрации растворенного вещества. Первые два члена разложения дают т)
= i)0(l + fo]c), где т)0 - вязкость чистого растворителя, a [ij] -
коэффициент, называемый характеристической вязкостью. Скомбинировав это
выражение с уравнением (10.68), введя затем полученный результат в
уравнение (11.28) и пренебрегая влиянием концентрации на плотность,
получим уравнение (11.41), в котором к' = [17]. В действительности,
однако, это уравнение обычно не слишком хорошо соответствует
экспериментальным данным. Найденные опытным путем значения к' зачастую
оказываются больше аналогичных значений [17]; исключение составляет ДНК.
Уравнение (11.42) соответствует случаю, когда главной причиной уменьшения
скорости седиментации при увеличении концентрации растворенного вещества
является противо-
16*
244
ГЛАВА 11
J
J
Г
J
X
м
X
a
x
м
A
X
Б
x
РИС. 11.13. Сужение границы. А. Допустим, что в концентрированном
растворе ДНК образуется широкая граница. Тогда приведенная на рис. 11.12
зависимостью от концентрации означает, что различные точки этой границы
движутся с весьма неодинаковыми скоростями. Б. В концентрированном
растворе ДНК широкая граница никогда в действительности не наблюдается.
Здесь формируется сверхрезкая граница, стабилизированная эффектами,
показанными на рис. А.
ток растворителя. Например, сферическая частица увлекает за собой
приблизительно в четыре раза больший, чем занимает она сама, объем
растворителя. Поэтому при седиментации макромолекул значительно больший
по объему поток растворителя протекает в ячейке в направлен(tm), обратном
направлению седиментации. Этот поток прямо пропорционален объему
седиментирующих макромолекул, умноженному на их скорость. С точки зрения
наблюдателя, находящегося вне ячейки, движение макромолекул замедляется,
на самом деле они "плывут" против течения. В гл. 12 мы покажем, что
коэффициент Ы в разложении вязкости в степенной ряд прямо пропорционален
объемной доле, занимаемой растворенным веществом. Таким образом, к' и к"
связаны между собой и в предельном случае низких концентраций совпадают.
При высоких концентрациях ни уравнение (11.41), ни уравнение (11.42) не в
состоянии достаточно хорошо объяснить экспериментальные данные, и в этом
случае требуются более сложные выражения.
Форма наблюдаемой в седиментационном опыте границы может очень сильно
зависеть от концентрации растворенного вещества. При центрифугировании
концентрированного раствора ДНК молекулы в области плато седиментируют
медленно (как показано на рис. 11.12), поскольку на них в полной мере
сказывается влияние высокой концентрации. Допустим, что граница широкая
(рис. 11.13, А). Концентрация тех молекул ДНК, которые находятся в
хвостовой части границы, очень мала, и поэтому они должны седиментировать
очень быстро. Но тогда они догонят те молекулы, которые находятся в
головной части границы, т.е. широкая граница не может образоваться, даже
если диффузия значительна. Граница сжимается и при дальнейшей
седиментации остается резкой (рис. 11.13, Б) независимо от степени
гетерогенности препарата по молекулярным массам.
ВЛИЯНИЕ САМОАССОЦИАЦИИ НА СКОРОСТЬ СЕДИМЕНТАЦИИ
Как показывает одна из экспериментальных кривых, изображенных на рис.
11.12, с увеличением концентрации коэффициент седиментации может и
возрастать. Пользуясь аргументацией, в точности противоположной той,
которая употреблялась для объяснения сжимания границы, можно предсказать,
что в этом случае должно происходить уши-рение границы. Действительно,
так оно и есть, но чем это вызвано? Допустим, что белковый мономер Р
способен к самоассоциации с образованием олигомеров вида 2Р ** Р2 или еще
больших агрегатов по формуле пР ** Рп. Если скорости взаимных превращений
пре-
245
небрежимо малы (по шкале времени седиментационного опыта), то мы должны
