Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
разделить на жирные, алифатические дикарбо-новые, алифатические
оксокарбокарбоновые и алифатические гидроксикарбоновые, фенолы,
ароматические, фуранокарбоно-вые и азотсодержащие алифатические и
ароматические кислоты и кислые конъюгаты.
Анализ органических кислот имеет большое значение как для
фундаментальных биохимических исследований, так и для прикладной и
клинической биохимии. Объектами исследования фундаментальной биохимии
могут быть, например, процессы разрушения различных соединений, процессы
ш-окисления при метаболизме жирных кислот или процессы биосинтеза
кетоновых тел и высокомолекулярных кетоновых тел. Объектом прикладных
исследований может быть диагностика, основанная на установлении
аномальной концентрации ряда органических кислот в моче или сыворотке
крови в патологическом состоянии организма, например повышенного
содержания в моче фенилпировино-градной кислоты, наблюдаемого вследствие
врожденного дефицита активности фермента фенилаланин-4-гидроксилазы, или
ванилилминдальной кислоты в моче при таких опухолевых заболеваниях, как
фаеохромоцитома или нейробластома. В данной главе будут рассмотрены в
основном прикладные аспекты, свя-
Органические кислоты в организме человека 615
занные с аналитическим определением органических кислот, иными словами,
будет рассмотрена возможность использования органических кислот в
качестве диагностических маркеров.
13.2. Методические аспекты
13.2.1. Выделение органических кислот
В некоторых случаях обнаружение и количественное определение
индивидуальных органических кислот может быть осуществлено
непосредственно в биологических жидкостях при помощи специфических
реакций. Содержание молочной кислоты измеряют при помощи ферментативной
реакции, катализируемой лактат-дегидрогеназой [1], ацетоуксусной кислоты
- при помощи реакции, катализируемой ферментом ^-гидроксибути-рат-
дегидрогеназой [2], мочевой кислоты - на основе колориметрической [3] или
ферментативной [4] реакции, фенилпиро-виноградной кислоты - при помощи
колориметрической реакции [5]. Определение некоторых кислот можно
осуществить методом ВЭЖХ без какой-либо предварительной обработки
биологических образцов. Таким способом определяют, например, гип-пуровую
кислоту в моче [6], 5-гидроксииндолил-З-уксусную кислоту в моче [7] и
спинномозговой жидкости [8], гомованилино-вую кислоту в моче [9] и
спинномозговой жидкости [8]. Непосредственный анализ пробы мочи методом
ВЭЖХ позволяет также установить профиль органических кислот [10, 11].
В большинстве случаев, в частности при применении ГХили ВЭЖХ - двух
основных аналитических методов разделения, органические кислоты следует
предварительно выделить из биологического материала. Выделение кислотных
компонентов осуществляется экстракцией органическими растворителями и
анионообменной хроматографией.
Экстракцию, как правило, проводят диэтиловым эфиром [12-15],
этилацетатом [16-24] или их смесью [25, 26], например, в соотношении 1:1.
Другие растворители, в том числе дихлорметан [27], дихлорметан/грег-
амиловый спирт (2:1) [28], дихлорметан/изопропанол (9:1) [29],
бензол/этилацетат (1:1) [30], используются реже. Для улучшения экстракции
образцы мочи или сыворотки крови можно насыщать солями, например хлоридом
натрия. Эти методы не требуют значительных затрат времени, так как они
осуществляются чаще в периодическом, а не в непрерывном режиме. Однако
они не являются количественным для многих органических кислот, особенно
по-лигидроксикарбоновых и других сильнополярных кислот. Из исследуемых
жидкостей перед проведением экстракции необходимо удалять белки путем
диализа или осаждения. Последовательный метод предпочтителен, поскольку
при диализе часть
616 Глава 13
связанных с белком органических кислот может теряться. Следует иметь в
виду, однако, что некоторые органические кислоты могут соосаждаться с
белками.
Выделение органических кислот при помощи анионообмеи-ной хроматографии
используется часто, особенно при изучении профиля кислот. В этих целях
применяют ДЭАЭ-сефадекс [31 - 34], даузкс [35], амберлист А-26 [36, 37] и
другие анионообменные смолы. Анионообменная хроматография более
трудоемка, чем экстракция, но позволяет получать количественные выходы
кислот. Поэтому ее применение предпочтительно в тех случаях, если
необходимо детальное изучение содержания органических кислот различных
классов, включая гидроксикарбоно-вые кислоты, или если необходимо
определить незначительные изменения содержания органических кислот.
Преимущества метода выделения полигидроксикарбоновых кислот при помощи
хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе по сравнению с осаждением смесью
диэтиловый эфир/этилацет подробно обсуждены в работе [38]. Следует также
отметить, что авторы работы [39] получили хорошие результаты при
построении профиля органических кислот с использованием колонки с
зкстралутом (Extre-lut).
13.2.2. Получение производных органических кислот
