Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
При разделении органических кислот методом ВЭЖХ их не нужно переводить в
производные, отличающиеся повышенной летучестью и термостойкостью, что
необходимо при применении ГХ. Поэтому во многих случаях выделенные
органические кислоты непосредственно исследуют методом ВЭЖХ. Однако
разделение органических кислот в виде производных позволяет повысить
чувствительность обнаружения. Фенилпировиноград-ная кислота реагирует с
4'-гидразин-2-стильбазолом в водном растворе метанола с образованием
соответствующего флуоресцирующего гидразона [30], или же ее можно
подвергнуть пред-колоночной модификации 2,3-диаминонафталином для
увеличения чувствительности УФ-обнаружения [40]. 2-Оксокарбоновые кислоты
разделяют (и обнаруживают) в виде 2,4-динитрофе-нилгидразонов [41] или
хиноксалинов после реакции с о-фени-лендиамином [42]. В сыворотке крови
обнаруживают свободные жирные кислоты по флуоресцентной метке (4-
бромометил-
7-метоксикумарин) [29, 43].
Для разделения органических кислот при помощи ГХ получение производных
является необходимым условием. Чаще всего кислоты хроматографируют в виде
триметилсилиловых или метиловых эфиров. Триметилсилилироваиие
осуществляется обработкой бис(триметилсилил)трифторацетамидом (БСТФА)
[25, 33, 44-49] или бис(триметилсилил) ацетамидом [22-24,
Органические кислоты в организме человека 617
32, 50-53]. Метилируют чаще всего органические кислоты диазометаном [13,
26, 36, 39, 54-59].
Методы разделения и обнаружения органических кислот в виде
триметилсилиловых и метиловых эфиров имеют ряд и достоинств, и
недостатков. В целом предпочтение может быть отдано метиловым эфирам.
Если для идентификации органических кислот применяется хромато-масс-
спектрометрия, то предпочтительны метиловые эфиры, поскольку
интерпретация их масс-спектров менее сложна, так как структура
образующихся фрагментов более проста и результаты легче предсказать. При
условии соблюдения необходимых мер предосторожности метилирование
диазометаиом представляет собой очень простую и быструю процедуру. Тем не
менее и ей свойственны определенные недостатки. Во-первых, метилированию
подвергаются гидроксильные группы фенолокислот, что не позволяет провести
различие между исходными ароматическими ОН-группами и ОСНз-группами. Во-
вторых, в процессе обработки диазометан может вступать в реакцию с
двойными связями ненасыщенных дикарбоновых кислот, например фумаровой.
Это приводит к возникновению ложных пиков. Недостатки такого же рода
можно ожидать и при хроматографировании триметилсилильных эфиров.
Среди других методов модифицирования карбоксильных групп органических
кислот можно упомянуть получение гекса-фторизопропиловых [60, 61] и
пентафторбензиловых [62] эфиров, используемое, в частности, при
обнаружении электронозахватным детектором.
Кроме карбоксильных групп модифицированию могут подвергаться и другие
функциональные группы органических кислот. Гидроксикарбоновые кислоты
образуют триметилсилиловые эфиры (при триметилсилилировании). При
метилировании же этого обычно не происходит.
Карбонильные группы оксокарбоновых кислот трансформируют в оксимы [23,
24, 53, 63], О-метилоксимы [36], О-этилок-симы [31, 46] или О-
триметилсилилхиноксалины [64, 65]. Большинство оксокарбоновых кислот
неустойчивы в условиях ГХ-анализа, если их карбонильные группы находятся
в немодифи-цированном состоянии. Фенольные ОН-группы модифицируют с
помощью ангидридов трифторуксусной [60, 61] или гептафтор-масляной [62]
кислот, что позволяет осуществлять обнаружение с помощью
электронозахватных детекторов.
13.2.3. Предварительное фракционирование
В сыворотке крови и моче содержатся очень сложные смеси органических
кислот, поэтому необходимо проводить предварительное фракционирование
анализируемого образца, особенно
40-1489
618 Глава 13
Ют сыворотки или мочи [
+20 мп изопропанола
Центрифугирование
I Надосадачная I 1 жидкость I
АмберлистА-26,
( муравьиная киспота/метатл
Органические I
кислоты |
Ди азометан
Метиловые эфиры
тех, кизепьгепь 60 F, н -гептан/диэтиловый эфир/ хлороформ циклогексан/
метанол / хлороформ
Фракции
Экстрактор Сокслета, дихлорметан
|10мл сыворотки или мочи \
+20мп изопропанопо
[центрифугирование
НадосаЗочнсгя
жидкость
+ 5 0мг h3conh2*hci
I 65"С, 1ч, центрифугирование
О метилоксиметилированная проба |
АмберлистА-25,
муравьиная кислота /метанол
Q-метипоксиметипированная кислота\
Диазометан
Метиловые эфиры О-метил-
оксиметилированных кислот
тех, кизепьгепь COh
__________
Фракции
Экстрактор Сокслетп, дихлорметан
Рис. 13.1. Схема анализа оргаииче- Рис. 13.2. Схема анализа оксокарбо-
