Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Laboratory of Viral Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, USA R. Rothstein
Department of Human Genetics and Development, Columbia University, College of Physicians and Surgeons, New York, USA
G. L. Smith
Laboratory of Viral Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, USA
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
APRT — аденинфосфорибозил—трансфераза ars — автономно реплицирующийся сегмент BPV-1 —вирус бычьей папилломы I типа BUdR — 5-бромдезоксиуридин CAT — хлорамфеникол-ацетил—трансфераза Cm — хлорамфеникол DHFR — дигидрофолатредуктаза DMEM—среда Игла в модификации Дульбекко DMSO — диметилсульфоксид
FCS — фетальная телячья сыворотка [Jgal —¦ ^-галактозидаза gdDNA— двухцепочечная ДНК с одноцепочечными участками GH — гормон роста НА — гемагглютинин HBS — солевой буфер с Hepes HbsAg — поверхностный антиген вируса гепатита HSV-1 — вирус простого герпеса I типа IF— интерферон IMP — инозинмонофосфат IPTG — изопропил- Ьтио-р-Б-галактозид Km — канамицин LTR — длинный концевой повтор МЕМ — минимальная среда Игла MES — 2[Ы-морфин]этансульфоновая кислота MMTV — вирус опухоли молочной железы мыши MSV — вирус саркомы Молони NPTII — неомицинфосфотрансфераза ONPG — О-нитрофенил-р-Б-галактозидаза ORF — открытая трансляционная рамка PBS — фосфатно-солевой буфер PEG — полиэтиленгликоль RSV — вирус саркомы Рауса SAM — Б-аденозил-Ь- [метил- зН] метионин SB — буфер для простой трансформации SDS —додецилсульфат натрия Sm — стрептомицин
12
Список сокращений
Su — сульфонамиды T-DNA — трансформирующая ДНК Ti-плазмид TBS — трис-солевой буфер Тс — тетрациклин TES — Ы-трис(гидроксиметил) метил-2-аминоэтансульфоно-вая кислота TFB — буфер для трансформации ТК — тимидинкиназа X-Gal — 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-Б-галактозид
КНИГА I
ГЛАВА 1
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЕКТОРОВ ЗАМЕЩЕНИЯ НА ОСНОВЕ ФАГА ЛЯМБДА ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЬНЫХ БИБЛИОТЕК ГЕНОМНОЙ ДНК
Ким Кайзер и Норин Мюррей
1. Полная библиотека
Полная библиотека генома должна содержать все представляющие этот геном последовательности ДНК в стабильной форме и в не слишком большом числе перекрывающихся клонов. Величина клонированных фрагментов должна быть достаточно велика, чтобы включать в себя полные гены и прилежащие к ним области. С другой стороны, эти фрагменты должны быть достаточно малы, чтобы легко картироваться при помощи ре-стриктаз. Весьма важно, чтобы библиотеку несложно было получить из небольшого количества исходного материала и в то же время легко проверить на наличие интересующей последовательности, чаще всего при помощи гибридизации с радиоактивными ДНК- или РНК-зондами. Перекрывание между клонами делает возможным «прогулку» по соседним участкам генома. С этой же целью в библиотеке должна быть предусмотрена возможность вырезания ДНК-вставки и отделения ее от последовательностей вектора, с тем чтобы вставка в свою очередь могла использоваться в качестве радиоактивного зонда. В идеале библиотека должна амплифицироваться без потерь и перестроек и храниться в течение нескольких лет без значительного падения титра.
Этим требованиям, хотя бы частично, в настоящее время отвечают лишь векторы на основе фага К и космид. Космидные векторы обладают большой емкостью ( — 45 т. п. н.), но они менее удобны для работы, чем векторы на основе фага X, максимальная длина вставки для которых не превышает 20—25 т. п. н. В любом случае библиотека, представляющая сложный эукариотический геном, должна состоять из довольно большого числа индивидуальных рекомбинантов— 105—106. В настоящее время наиболее эффективными и простыми в работе векторами для стандартного конструирования библиотек геномной ДНК считаются векторы на основе фага К (сравнительные характеристики космид и А-векторов обсуждаются в разд. 17).
14
Глава 1
2. Принципы клонирования в ^-векторах замещения
Обоснованный выбор А,-вектора требует ясного представления о механизмах взаимодействия фага Я с клеткой-хозяином. Однако мы предпочли сначала изложить основные методические принципы конструирования геномных библиотек и лишь затем подробно обсудить те свойства фага X (разд. 13), которые важны для осознанного использования векторов, полученных на его основе.
Хромосома бактериофага X представляет собой линейную молекулу ДНК длиной 48,6 т. п. н. [3], при этом установлено, что почти 40% генома не являются обязательными для размножения фага. В результате множества манипуляций in vivo и in vitro сейчас в нашем распоряжении имеется большое количество А,-векторов для размножения чужеродной ДНК, вот почему выбор подходящего вектора может вызвать затруднения [1, 2, 4, 5, 6, 7, 8]. Здесь мы рассмотрим только векторы, относящиеся к классу векторов замещения, в особенности те из них, которые способны включать крупные фрагменты чужеродной ДНК и таким образом сводить к минимуму число рекомбинантов, необходимых для построения полной библиотеки генома.
Стратегия использования любого из векторов замещения приведена на рис. 1. При расщеплении векторной ДНК подходящей рестриктазой образуются три фрагмента (рис. 1 , Л): два из них, левое плечо и правое плечо, вместе содержат всю генетическую информацию, необходимую для образования инфекционной фаговой частицы; кроме того, в состав вектора входит центральный фрагмент. Центральный фрагмент не содержит необходимых для размножения генов и служит просто для «подгонки» длины векторной ДНК. Векторы замещения названы так именно потому, что центральные фрагменты их ДНК могут быть замещены фрагментами чужеродной ДНЮ В фаговую частицу с высокой эффективностью могут быть упакованы сегменты ДНК длиной от 40 до 50 т. п. н. Лигирование двух пле-чей вектора приводит к образованию молекулы ДНК, длина которой недостаточна для упаковки, что в свою очередь обусловливает обогащение фаговой популяции рекомбинантами.
