Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Фрагменты ДНК, полученные в результате расщепления рестриктазой (рестрикты), имеют комплементарные «липкие концы» (рис. 1,Л). Если такие рестрикты смешать с фрагментами чужеродной ДНК, тоже имеющими липкие концы, и добавить ДНК-лигазу, то часть вновь образовавшихся молекул вектора между правым и левым плечами будет содержать фрагмент чужеродной ДНК. Если такую рекомбинантную молекулу ДНК ввести в бактериальную клетку, последняя лизируется и даст начало клону фаговых частиц. Негативные колонии (фаговые бляшки), образовавшиеся в результате лизиса индиви-
Ют.пд.
I---------»
Лев.плечо ^цеарагмьент'й Ц Пр.пдечо
А. ДНК вектора,
расщепленная рестрикций
I
^ . Лев, плечо Ц Ццеар?гмейт|Я~Ц Цпр.ппечо
В. Отжиг тщеч и удаление центрального фрагмента
I
Цпр.плечоЩ Лев.плечо L| +
В. Лигирование с фрагментами донорной ДНК (18-22т.и.н.)
I
|Пр. плечо Ш лев. плечо
L
|Пр.плечоЩ^ лев, плечо V ___________)
Г. Упаковка in vitro
конкатенированных моленул ДНК
Д. Заражение нлеток Е. coli
и получение негативных колоний(бляшек) фаговых рекомбинантов на бактериальном газоне
Рис. 1. Стратегия клонирования с использованием Я-векторов замещения. При расщеплении ДНК вектора подходящим ферментом образуются липкие концы, к которым при помощи лигазы присоединяются имеющие комплементарные концы фрагменты донорной ДНК. Заштрихованные области обозначают собственные липкие концы фага X. Как показано на рисунке, липкие концы фага отжигают перед лигированием. Конкатенированный продукт реакции лигирования упаковывают- in vitro в инфекционные фаговые частицы, каждая из которых, размножаясь, образует бляшку на газоне бактерий. Реплику (отпечаток) поверхности чашки с фаговыми бляшками можно получить, накладывая на поверхность этой чашки нитроцеллюлозный фильтр (разделы 9 и 18.10).
Впоследствии фильтр используют для гибридизации с ДНК-зондом.
16
Глава 1
дуальной зараженной бактерии, будут содержать амплифици-рованные рекомбинантные хромосомы, несущие соответствующую последовательность из популяции донорных фрагментов.
Эта простая процедура несколько усложняется вследствие того, что на концах самой векторной молекулы ДНК имеются комплементарные одноцепочечные участки (липкие концы) (рис. 1 ,Л). Их существование делает возможным отжиг левого и правого плечей фага друг с другом (рис. 1,5). При этом образуются конкатенированные молекулы рекомбинантной ДНК, состоящие из многих геномов (рис. 1 ,В). Из такой конкатенированной молекулы, однако, нетрудно получить вновь мономерные геномы (разд. 4.1 и 13.1).
Молекулы фаговой ДНК, как рекомбинантные, так и нативные, можно ввести в бактериальную клетку в виде свободной ДНК (трансфекция) с эффективностью >104 рекомбинантных клонов на 1 мкг донорной ДНК. Такой эффективности достаточно для конструирования и размножения библиотек небольших геномов (например, геномов Е. coli или дрожжей). При работе с большими геномами для того, чтобы количество исходного материала не было лимитирующим фактором, а также для достижения высокой плотности рекомбинантных бляшек на чашке желательна более высокая эффективность. Если перед введением в бактериальные клетки молекулы рекомбинантной ДНК in vitro «упаковать» в частицы фага, можно добиться эффективности более чем 106 рекомбинантных клонов на 1 мкг донорной ДНК (рис. 1,Г).
( Для получения полных библиотек высокомолекулярную геномную ДНК фрагментируют с помощью рестриктазы, для которой среднее расстояние между сайтами узнавания мало по сравнению с желаемым размером вставки, а липкие концы совместимы с вектором^ В результате получают набор перекрывающихся фрагментов ДНК, который в первом приближении представляет весь геном. В рекомбинантных клонах будут представлены лишь те чужеродные фрагменты, которые образуют рекомбинантные молекулы фаговой ДНК, подходящие по размерам для упаковки. Это требование удовлетворяется либо при включении в состав рекомбинантной молекулы одного крупного фрагмента ДНК, либо нескольких меньшего размера (множественная вставка). Такие множественные вставки нежелательны, так как входящие в их состав фрагменты могут и не соседствовать в исходном геноме, что создает трудности при анализе рекомбинантных молекул. Во избежание этого экзогенные молекулы ДНК обычно фракционируют по размеру и в реакцию лигирования вводят лишь те молекулы, которые имеют достаточно большой размер. В таком случае при множественной вставке образуются фаговые геномы, не способные к упаковке из-за слишком большой длины.
____Использование Х-векторов дт конструирования библиотек ДНК_17
Если исходный центральный фрагмент не удалить после расщепления векторной ДНК и перед лигированием, то часть образовавшихся молекул фаговой ДНК вновь включит его в свой состав. Чтобы этого не произошло, нужно перед лигированием отделить центральный фрагмент от плеч вектора (рис. 1,5). Тогда любой жизнеспособный фаговый геном, образовавшийся при лигировании, будет содержать фрагмент чужеродкой ДНК, а библиотека (теоретически) не будет загрязнена последовательностями родительского фага. Выделять ДНК плеч фага в чистом виде необязательно, если используемый вектор до-пускает генетическую селекцию против нерекомбинантных фа-гов в процессе размножения библиотеки (разд. 14 и 15).
