Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
ГРАДИЕНТ ПОРИСТОСТИ ПААГ
В конце предыдущего раздела было рассмотрено несколько примеров использования градиентов пористости ПААГ. Теперь рассмотрим возможности этого метода подробнее.
Техника приготовления гелей с изменяющимися бдоль tta-правления миграции белков размерами пор, или, как их называют, «градиентов пористости ПААГ», была подробно описана в главе 2. Постепенное уменьшение среднего размера пор вдоль градиента достигается путем увеличения концентрации акриламида. Электрофорез в градиенте пористости ПААГ имеет целый ряд существенных преимуществ.
Во-первых, ему присуще самоограничение миграции белков в геле. По мере продвижения в электрическом поле белковые зоны попадают в области все более мелких пор, трение о гель усиливается и движение зон замедляется. Если размеры белков достаточно велики, то в какой-то момент времени миграция их может практически прекратиться. Для разных зон этот момент наступает не обязательно одновременно. Белки каждой зоны мигрируют до своего конечного .положения, соответствующего их размерам, независимо друг от друга. Достигнув этого положения, они могут оставаться в нем неограниченно долго. Для белков разной величины конечные положения окажутся в разных участках градиента пористости. К моменту окончания процесса фракционирования в целом все белковые зоны займут свои стационарные положения и останутся в них до тех пор, пока будет включено электрическое напряжение. Таким образом, экспериментатору нет нужды наблюдать за окончанием электрофореза. Его продолжительность можно выбрать «с запасом», например поставить опыт на ночь.
Во-вторых, в ходе электрофореза происходит непрерывное сужение белковых зон. Оно происходит потому, что белки в передней части каждой зоны постоянно оказываются в области чуть более мелких пор, чем идущие в задней части этой же зоны. Впереди идущие белки, таким образом, тормозятся гелем немного сильнее, а идущие сзади их постепенно догоняют. Этот процесс противодействует диффузии белков из зоны. Убедительная иллюстрация эффективности такого противодействия была приведена выше (см. рис. 16).
При электрофорезе в градиенте пористости ПААГ отпадает необходимость в первоначальном сужении полос. Можно вести электрофорез в простой непрерывной системе и не очень заботиться об объеме исходного препарата. Сделанное замечание находится в противоречии с цитированными выше недавними работами, где градиентный гель использовали в сочетании со ступенчатым электрофорезом по Лэммли. Возможно, что при таком сочетании хорошее разделение зон достигается быстрее, но не исключено, что в некоторых конкретных случаях оно обусловлено определенным консерватизмом и «перестраховкой».
По существу, картина разделения белковых зон при электрофорезе в градиенте пористости ПААГ зависит только от соотношения размеров белков в препарате и характера градиента пористости. Выбор буфера и электрического режима электрофореза играет второстепенную роль. Поэтому, в частности, можно
использовать любые буферы сравнительно малой концентрации (0,03—0,05 М), достаточной лишь для сохранения знака заряда белка. Это позволяет повысить напряженность поля, что для данного метода немаловажно, так как скорости миграции белков при приближении к конечным положениям существенно уменьшаются.
Указанные преимущества объясняют растущую популярность градиентных гелей, несмотря на большую сложность их приготовления по сравнению с обычным ПААГ. Легко понять, почему такая ведущая фирма, как «Pharmacia», специализировалась на выпуске стандартизированных градиентных ПААГ. Фирма предлагает гели в виде пластин с рабочими размерами 78X78X2,7 мм для двух интервалов концентраций .ПААГ: 2— 16% и 4—30% (РАА 2/16 и РАА 4/30). Профиль градиента пористости в этих пластинах подобран так, что в пределах некоторого диапазона молекулярных масс нативных глобулярных белков они обеспечивают линейную зависимость расстояния миграции белка (до конечного положения) от логарифма его молекулярной массы. Калибровочные данные прилагаются фирмой к каждому гелю вместе с указанием стандартных условий фракционирования. Рабочие диапазоны молекулярных масс таковы: для РАА 2/16 —от 100 тыс. до 5 млн. дальтон, для РАА 4/30 — от 50 тыс. до 2 млн. Для РАА 4/30, например, это означает, что при достаточно длительном электрофорезе белки с молекулярной массой менее 50 тыс. могут выйти из геля, а имеющие массу более 2 млн. — не войдут в него. Последняя цифра может относиться, конечно, только к белковым комплексам или нуклеиновым кислотам.
Градиентами пористости ПААГ можно, как мы видели, пользоваться и для разделения комплексов белок—ДДС-Na. Ламбен обнаружил, что для белков, обработанных ДДС-Na, линейный градиент концентрации ПААГ в интервале 3—30% позволяет проводить электрофорез до полной обстановки белков с молекулярными массами от 13 до 950 тыс. дальтон. При этом аправедливо-следующее линейное соотношение: \gM=A lgТ+В, где М — молекулярная масса белка, а Т — концентрация ПААГ в месте расположения белковой полосы. Для линейного градиента эта концентрация легко вычисляется по расстоянию полосы от начала пластины. Л и 5 — коэффициенты, указывающие на линейный характер зависимости. Определять их нет нужды, если имеется возможность воспользоваться, как обычно, набором маркерных белков. Обработку исходного препарата можно проводить в тех же условиях, что для обычного электрофореза в ПААГ с ДДС-Na [Lambin, 1978).
