Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
В каждом из направлений двумерного электрофореза используют одну из рассмотренных выше систем, отвечающую специфическим особенностям фракционируемых белков. Широкое применение двумерный электрофорез нашел, например, для
Рис. 23. Вкладыш из плексигласа для двумерного электрофореза [Hoffman, Dowben, 1978а]
Рис. 24. Результаты двумерного электрофореза рибосомальных белков [Mets, Bogorad, 1974]
I — первое направление; II — второе направление
анализа белков рибосом из разных источников. Это, в основном, слабощелочные белки, и в первом направлении их разделяют чаще всего по заряду. Для этого используют крупнопористый гель, чтобы различие молекулярных размеров по возможности не сказывалось на разделении белков в этом направлении, т. е. не накладывалось на разделение по заряду. Во втором направлении в этом случае белки разделяют по их размерам.
Так, Мете и Богорад электрофорез рибосомальных белков в первом направлении проводили в трубках диаметром 4 мм и длиной 10 см [Mets, Bogorad, 1974]. 4%-ный ПААГ полимери-зовали в буфере с pH 5. При этом все рибосомальные белки заряжены положительно и различия значений их суммарных зарядов выражены наиболее ярко. В буфер вводили 8 М мочевину, чтобы помешать агрегации белков. При полимеризации геля вносили больше ТЕМЕД, чем персульфата аммония (0,1 и 0,03%), так как в кислой среде каталитическая активность ТЕМЕД понижена (см. главу 2). 0,1—0,2 мг смеси рибосомальных белков вносили растворенными в 8 М мочевине с 10 мМ ди-тиотреитолом. Разделение вели при силе тока 1,5 мА на трубку в течение 4—5 ч. Во втором направлении использовали ступенчатый электрофорез. Рабочим гелем служил 10%-ный ПААГ, полимеризованный в буфеде с pH 6,75. Формирующий гель — такой же, как гель первого направления (4% ПААГ, pH 5). Его полимеризовали вокруг геля из трубки, уложенного в клиновидное расширение над пластиной. Концентрацию мочевины в этом геле снизили до 7 М, чтобы цилиндрик не мог всплыть во время полимеризации. В качестве медленно мигрирующего иона верхнего электродного буфера использовали MES (2-(N-морфолино-
этенсульфокислоту) — продажный препарат для составления буферов с рКа 6,15. Быстрым ионом служил остаток уксусной кислоты. В состав верхнего буфера ввели также 1% ДДС-Na и 0,01 % тиогликолевой кислоты, которая, как уже упоминалось, служит для очистки гелей от остаточных свободных радикалов персульфата аммония. Она мигрирует из электродного буфера в гель, где и движется впереди белков. Отметим, что преэлек-трофорез в ступенчатой системе невозможен — он нарушил бы распределение ионов по ступеням. Однако его можно провести предварительно, использовав в качестве верхнего обычный буфер с быстро мигрирующим ионом, а затем заменить его, как описано выше. Верхний электрод является катодом, анод расположен внизу. Под действием поля ДДС-Na из верхнего электродного буфера мигрирует в гель. В цилиндрике геля первого направления он образует комплексы' с белками. Далее отрицательно заряженные комплексы белок—ДДС-Na выходят из цилиндрика и фракционируются ступенчатым электрофорезом в пластине. Обработка белков ДДС-Na, таким образом, происходит в отсутствие fi-меркаптоэтанола. Его отчасти заменяет мочевина; кроме того, исходно, до электрофореза в первом направлении, белки восстанавливают 10 мМ дитиотреитолом. Электрофорез во втором направлении ведут в течение 5 ч при силе тока 25 мА на пластину. Метод удобен тем, что между разделениями в первом и втором направлениях нет надобности вымачивать гель, так как буфер геля первого направления — тот же, что и у формирующего геля второго направления. Результаты электрофореза представлены на рис. 24.
В другой работе [Howard, Traut, 1973} разделение рибосо-мальных белков по заряду в первом направлении вели тоже в 4%-ном ПААГ в присутствии 6 М мочевины, но в 0,4 М Трис-боратном буфере, pH 8,7. При этом pH часть белков рибосом оказывается заряженной отрицательно, а другая часть — положительно. Белковый препарат смешивали с расплавленной 1%-ной агарозой и вносили в середину трубки, наслаивая его на заполимеризованный нижний участок ПААГ. После затвер* девания агарозы в трубку заливали новую порцию смеси моно« меров и полимеризовали верхний участок ПААГ. При этом ie интересах концентрирования полос на обеих границах с ПААГ агарозу с белковым препаратом полимеризовали в разбавленном (0,06 М) Трис-боратном буфере. При включении напряжения миграция белков шла в обе стороны —к катоду и аноду. Во втором направлении разделение белков вели по их размерам, но без обработки ДДС-Na. Для этого использовали пластину еще более мелкопористого геля, чем в предыдущей работе (Т= = 18,25; С=1,37), полимеризованного в 0,9 М уксусной кислоте, титрованной КОН до pH 4,5, также с добавлением 6 М мочевины. В этом случае все белки были заряжены положительно и мигрировали к катоду. В качестве лидирующего красителя использовали 0,1%-ный раствор пиронина. Из цилиндрика геля
вдоль его продольной оси вырезали плоскую полоску, вымачивали ее в 0,013 М К-ацетатном буфере (pH 5,2) с 8 М мочевиной. Полоску зажимали между стеклянными пластинками формы и прямо на нее заливали раствор мономеров рабочего геля. Катионом верхнего электродного буфера служил глицин (~0,19 М), титрованный уксусной кислотой до pH 4. Таким образом, осуществлялась система ступенчатого электрофореза, где в качестве быстрого иона выступал К+, а медленного— глицин. Отметим, что в системе Орнстейна и Дэвиса глицин фигурировал в качестве медленного аниона, а здесь он служил катионом. Возможность такого двоякого использования вытекает из цвиттерионной природы глицина. Формирующим гелем в этой системе служила сама полоска, вырезанная из геля первого направления. Аналогичная система двумерного электрофореза ри-босомальных белков описана и в другой работе [Sherton, Wool, 1974].
