Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
В качестве рабочего буфера геля использовали 0,1 М Na-фосфат (pH 7) с 0,1% цетавлона. Белковый препарат перед электрофорезом денатурировали в течение 1 мин на кипящей водяной бане в том же буфёре, но содержащем 0,5% цетавлона и 10—15% .р-меркаптоэтанола. Лидирующий краситель — малахитовый зеленый. Электрофорез в 10%-ном ПААГ при силе тока 8 мА на трубку (10X0,6 см) занимал около 5 ч. Белки фиксировали в кипящей 10%-ной ТХУ, затем окрашивали при комнатной температуре 0,5%-ным раствором СВВ R-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% этанола, в течение 10 ч.
Обработку цетавлоном удобно использовать для диссоциации белков от ДНК в хроматине с одновременным осаждением ДНК и последующим электрофорезом комплексов белков с- цетавлоном. При низких значениях pH связывание цетавлона с ги-стонами и негистоновыми белками хроматина носит избирательный характер, что способствует их электрофоретическому разделению.
Фракционирование белков по степени их гидрофобности можно преобразовать в разделение по заряду с помощью следующего приема [Helenius, Simons, 1977]. Для исключения роли размеров белков электрофорез ведут в 1%-ной агарозе, растворенной в 0,05 М глициновом буфере с 0,1 М NaCl и 0,5% Тритона
I-+ ©
• * Б в
% %
% % • %
% % * %
% • %
V V •Ч
0
Рис. 27. Обнаружение гидрофобных белков двумерным электрофорезом «со сдвигом заряда» [Bhakdi et al.» 1977]
А — без дополнительных детергентов; В — с добавлением ДОХ; В — с добавлением це-тавлона
X-100 с добавлением в него либо цетавлона до 0,5%, либо дез-оксихолата натрия (ДОХ) до 0,25%. Тритон Х-100 образует мицеллы, которые связываются с гидрофобными участками белка в количестве, пропорциональному размеру этих участков. Цетавлон или ДОХ объединяются с Тритоном Х-100 в смешанные мицеллы, привнося тем самым в комплекс с белком соответственно положительный или отрицательный заряд, существенно превышающий собственный заряд белка. При электрофорезе белки мигрируют со скоростью, обусловленной знаком и величиной привнесенного заряда. Такой прием можно назвать «электрофорезом со сдвигом заряда». Необычное введение в буфер геля 0,1 М NaCl по-видимому, способствует как растворимости белков, так и образованию мицелл. Напряженность поля при этом приходится снижать до 4,5 В/см.
Аналогичный подход был использован для обнаружения гидрофобных белков в двумерном варианте электрофореза [Bhakdi et al., 1977]. Разделение белков в первом направлении (I) вели в 1%-ной агарозе с 0,5% Тритона Х-100. Вырезали полоску, переносили ее в форму, куда заливали такой же раствор агарозы, но с добавлением цетавлона или ДОХ. После электрофореза во втором направлении (И) все гидрофильные белки ложились на диагонально расположенную прямую, а гидрофобные выпадали из нее (рис. 27).
Комбинация электрофореза в кислой мочевине с Тритоном Х-100 в первом направлении и такой же системы, но с цетавло-ном вместо Тритона, во втором позволила Боннеру и соавторам выявить значительное число дополнительных фракций при разделении гистонов двумерным электрофорезом. В обоих направлениях использовалась система ступенчатого электрофореза (3,3%-ный ПААГ — формирующий, 15%-ный — рабочий). Полимеризацию вели с рибофлавином. После электрофореза в первом направлении белки фиксировали и окрашивали СВВ. При этом отпадала необходимость вести электрофорез во. втором на-
правлении немедленно по окончании, первого разделения и обеспечивалась возможность оценить качество последнего. Цетав-лон, который вносили в верхний электродный буфер (0,1'5%), мигрируя под действием поля через полоску препарата, снова растворял белки и освобождал их от красителя. Во избежание образования дисульфидных мостиков в раствор красителя для геля первого направления добавляли до 0,1% цистамина. Для предупреждения фотоокисления. гистонов гели держали вдали от яркого света [Bonner et al., 1980].
В заключение отметим, что при электрофорезе мембранных липопротеидов главная проблема связана с их растворением. Даже в 1%-ном ДДС-Na при 100° не удается добиться надежного растворения. Между тем липопротеиды хорошо растворяются в смеси 6 г глицина и 10 мл 98%-ной муравьиной кислоты. Электрофорез можно вести в 13 М НСООН (50%). Для этого полимеризуют гель в воде, потом его вынимают, вымачивают в 13 М НСООН и с каплей глицерина вставляют в трубку, диаметр которой на 0,1—0,2 мм больше, чем у той, которая использовалась при полимеризации. В ней и ведут электрофорез [Мок-rasch, 1978]. В другом варианте электрофореза водонерастворимых белков в качестве рабочего буфера геля использовали смесь фенола, этиленгликоля и воды в соотношении 3:2:3 (масса/объем/объем). Мономерный акриламид реагирует с фенолом, поэтому полимеризацию ПААГ в пластинах проводили опять-таки в водной среде, которую затем путем вымачивания геля заменяли описанной выше смесью [Pusztai, Watt, 1973].
ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ В ПААГ
Обнаружение и локализацию белковых зон после их разделения электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуществляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как окрашенные полоски или пятна различной интенсивности, в зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вымачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания полос за это время белки иногда предварительно фиксируют осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10%- или 50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию совмещают с окрашиванием, используя раствор красителя в .смеси уксусной кислоты и метанола или в ТХУ.
