Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
В электродных резервуарах обычно используют тот же буфер, что и в геле. В буферы вносят и ДДС-Na до концентрацир/0,1%7 Необходимость присутствия ДДС-Na в рабочем буфере геля одно время оспаривалась [Stoklosa* Latz, 1974]. Авторы цитируемой работы утверждали, что ДДС-Na образует с белком прочный комплекс, не разрушающийся в процессе электрофореза. В более поздней работе, напротив, подчеркивается необходимость введения ДДС-Na в буфер геля или хотя бы в катодный буфер, откуда он будет поступать в гель. Показано, что ДДС-Na может выходить из комплекса с белком. В тех случаях, когда скорость миграции детергента в геле намного больше, чем бел-
Кй, йбеледний будет терять ДДС-Na й изменять свою йоДвйЖ-ность в геле [Kubo et al., 1979]. Это обстоятельство было предложено использовать в своеобразном процессе двухстадийного Электрофореза [Sorimachi, Condliffe, 1977]. После обычной обработки ДДС-Na и р-меркаптоэтанолом авторы сначала вели электрофорез в течение 2 ч в 10%-ном ПААГ, полимеризован-ном, как обычно, в 0,1 М Na-фосфатном буфере (pH 7) с 0,1% ДДС-Na. Через некоторое время буфер в катодном резервуаре заменяли на такой же, но без ДДС-Na. Это приводило к быстрой очистке геля от детергента, мигрирующего к аноду. Затем от ДДС-Na освобождались и белки. Дальнейшее разделение шло уже по заряду белков. При этом pH буфера можно с самого начала выбрать оптимальным именно для второго этапа разделения, поскольку на первом этапе в присутствии ДДС-Na pH роли не играет.
Подготовка белкового препарата
На эту операцию следует обратить особое внимание. Сопоставлять молекулярные массы белков по скорости их миграции можно только в том случае, когда есть уверенность в полной денатурации белка при обработке его ДДС-Na.
Вебер и сотрудники ввели широко употребимую до сих пор процедуру обработки. Белковый препарат дйализуют против 0,01 М Na-фосфата, содержащего 0,1% ДДС-Na и 0,1% р-мер-каптоэтанола, удаляя из него остатки соли. Затем концентрации ДДС-Na и p-меркаптоэтанола увеличивают до 1% (каждого) и прогревают препарат при 100° в течение 2 мин. Концентрация белка при этом должна составлять около 1 мг/мл (Weber et al., 1972]. Если предполагается присутствие в препарате протеаз, прогрев можно иродлить до 5 мин. Показано, например, что трипсин и химотрипсин сохраняют значительную каталитическую активность в присутствии 1 % ДДС-Na, но прогрев при 100° в течение 5 мин эту активность полностью подавляет [Porter, Preston, 1975]. Если же при высокой температуре наблюдается неферментативный гидролиз белка, то прогревание при 100° можно заменить инкубацией при 37° в течение 2 ч. Перед нанесением препарата на гель в него дополнительно добавляют р-меркаптоэтанол до концентрации 4—5%.
Несмотря на жесткость описанной обработки, авторы метода рекомендуют при определении молекулярной массы малоизученного белка проверить полноту его денатурации. Для этой цели они предлагают обрабатывать контрольный препарат белка по более сложной прописи, гарантирующей его полную денатурацию (7 М гуанидинхлорид и 1,5%-ный p-меркаптоэтанол с последующим алкилированием йодацетамидом). После этого формируют комплекс белка с ДДС-Na и сопоставляют Картины электрофореза белка, обработанного обычным способом, и контрольного препарата.
С другой стороны, некоторые белки, в частности липопротеи-ды, при кипячении с 1% ДДС-Na и 1% {i-меркаптоэтанола могут выпасть в осадок и не войти в гель. В этих случаях приходится уменьшать концентрацию p-меркаптоэтанола или не вводить его совсем.
При повышенной температуре иногда обнаруживается усиленный протеолиз исходных белков. Известно, что денатурация белка многократно увеличивает его доступность"для атаки про-теолитическими ферментами. ДДС-Na не входит в число их эффективных Ингибиторов. Если опасность протеолиза существует, в исходный препарат до денатурации белков вводят мощные ингибиторы протеаз: фенилметилсульфонилфторид (300 мкг/мл) и 1,10-фенантролин (1 мг/мл).
Проведение электрофореза
Что касается режима электрофореза, т. е. выбора рабочего напряжения, силы тока и продолжительности разделения, то здесь остаются в силе все те соображения, которые были приведены в предыдущем разделе. Вкладом ДДС-Na в электропроводность рабочего буфера можно при этом пренебречь. Электрофорез не следует вести на холоду, так как это может .повлечь за собой выпадение ДДС-Na в осадок (его растворимость очень сильно зависит от температуры). При длительном электрофорезе электродные буферы следует обновлять.
Для белков с молекулярной массой менее 12000 определение, ее электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na становится ненадежным! даже при высокой концентрации геля. В этом случае локальные' различия в составе и заряде белков, влияющие на их взаимодействие с ДДС-Na, уже не усредняются. Степень надежности определения молекулярной массы малых белков и олигопептидов увеличивается, как было указано, при введении в буфер 8 М мочевины, а также при увеличении степени сшивки геля.' В 12,5%-ном ПААГ с 0,1% ДДС-Na в присутствии 8 М мочевины при электрофорезе малых (данзилированных) олигопептидов с диапазоном М от 1 до 12 тыс. дальтон наблюдалась хорошая линейная зависимость lgM от Rt [Kato et al., 1975], однако точки для инсулина (Af=5782) и глюкагона (М—3483) из графика этой зависимости выпадали.
