Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Имеются подтвержденные данные о том, что система, предложенная Лэммли, чувствительна к качеству ДДС-Na [Swaney et al., 1974; Matheka et al., 1977]. Препараты, полученные от одних фирм («Pierce», «Matheson, Coleman and Bell»), дают хорошие результаты, в то время как с другими препаратами ДДС-
Na (BDH, «Serva») разрешение получается плохое, а белки менее подвижны. Этот эффект зависит и от того, какие белки разделяются. Для других буферных систем он не наблюдается, но белки разделяются в них зачастую вообще хуже, чем в системе Леммли. Природа описанного эффекта непонятна. По-видимому, при высокой концентрации Триса связывание ДДС-Na с белками зависит от молекулярного состава детергента. Анализ методом газовой хроматографии показывает, что продажные препараты ДДС-Na неоднородны. В них может содержаться до 10% примесей, имеющих значительно больше чем 12 атомов углерода на молекулу.
Отмечено также, что некоторые, особенно высокомолекулярные, белки после первоначального полного их восстановления обработкой р-меркап-тоэтанолом и ДДС-Na в ходе электрофореза снова частично окисляются с образованием дисульфидных мости-
Рис. 22. фракционирование ков междУ полипептидными цепями, РНК-полимераз I, II и III что приводит к размыванию полос и не-амебы в системе Лэммли воспроизводимости результатов раз-[D’AIessio et al., 1979] деления. Рекомендуется восстанов-
Цифрц слева — молекулярные ленное состояние белкового препарата массы некоторых субъединиц закреплять путем его алкилирования (тыс. дальтон) по SH-группам обработкой йодацета-
мидом. Для этого исходный препарат инкубируют с избытком этого реагента по отношению к количеству внесенного для восстановления белка р-меркаптоэтанола при 50° в течение 15 мин. От избытка йодацетамида и побочных продуктов реакции можно не избавляться, а наносить всю инкубационную смесь прямо на гель [Lane, 1978].
Ступенчатый электрофорез в сочетании с обработкой ДДС-Na успешно используется для пептидного анализа и сопоставления белков по пептидному составу. В 1977 г. группа авторов с участием Лэммли предложила для этой цели систему двумерного электрофореза, в которой ферментативный гидролиз белков проводят без их элюции, непосредственно в геле, после чего ведут электрофорез во втором направлении, позволяющий сопоставлять пептиды [Cleveland et al., WI7]. В первом направлении используют описанную выше систему Лэммли для разделения смеси сопоставляемых белков. После кратковременной окраски С целью обнаружения полос индивидуальных белков последние
39.0
37.0
гг, 5
17.5
15.5 13,3
вырезают й вымачивают в буфере формирующего геля. Затем их помещают в карманы пластины геля второго направления, добавляют туда по 10 мкл того же буфера, но содержащего 20% глицерина, а потом наслаивают еще по 10 мкл буфера, но с 10% глицерина, в котором растворена сооответствующая протеаза. Во втором геле снова сформирована система ступенчатого электрофореза по Лэммли. Включают напряжение, а когда бром-феноловый синий приблизится к границе рабочего геля, напряжение на 30 мин отключают. За это время протеаза, которая тоже перешла в формирующий гель, гидролизует белок непосредственно в нем. В присутствии ДДС-Na протеолиз проходит не полностью, но в определенных условиях воспроизводимо. В ходе дальнейшего электрофореза пептиды разделяются и могут быть сопоставлены в параллельных треках пластины.
Без существенных изменений этот подход был использован и другими авторами [Przybyla et al., 1979; Gadasi et al., 1979]. В аналогичной работе [Bordier, Crettol-Jarvinen, 1979] в первом направлении использовали систему Лэммли в сочетании с градиентом пористости рабочего геля в пластине — концентрация ПААГ изменялась от 5 до 17,5%. При внесении в карманы геля второго направления полоски индивидуальных белков, вырезанные из пластины первого направления, заливали расплавленным 1%-ным раствором агарозы, чтобы фиксировать их исходное положение на дне кармана. В другой недавней работе [Nikodem, Fresco, 1979] белки гидролизовали бромистым цианом. Как и в предыдущей работе, в первом направлении белки фракционировали ступенчатым электрофорезом с обработкой ДДС-Na в градиенте пористости геля, вырезали слегка окрашенные полоски белков и обрабатывали их BrCN прямо в геле. Реакцию вели в маленьких пластмассовых флаконах под тягой. Затем полоски геля вымачивали в буфере и переносили в карманы пластины второго направления для разделения пептидов. Другие авторы {Boulikas et al., 1980] аналогичным образом проводили промежуточный гидролиз белков в геле N-бромсукцин-. имидом. В первом направлении белки разделяли электрофорезом в «кислой мочевине».
Особенно совершенной оказалась двумерная система фракционирования белков и пептидов, предложенная О’Фаррелом [O’Farrel, 1975]. В этой системе во втором направлении также ибпользована методика Лэммли в сочетании с градиентом пористости ПААГ. Подробный разбор системы О’Фаррела и ее модификаций здесь провести нельзя, поскольку в первом направлении в ней используется не электрофорез, а электрофокусирование!
