Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Разделение улучшается в случае малых исходных количеств белка (1—5 мкг) и длинных гелей с расстоянием миграции около 15 см. При определении молекулярной массы неизвестного белка лучше начать подбор условий с 7,5%-ного ПААГ и соответствующего набора стандартных маркеров. Затем следует поварьировать условия — и, в частности, сопоставить значения молекулярной массы исследуемого белка, получающиеся в гелях с различным содержанием акриламида.
В цитированной выше работе Вебера и др. приведен список рколо 40 стабильных белков, которые можно использовать э кэ-
честве стандартных маркеров в интервале М 12—200 тыс. дальтон. Однако молекулярные маосы продажных белков, особенно при М>70 тыс., далеко не всегда надежно известны, поэтому фирма BDH при разработке своих стандартных наборов маркеров пошла по другому пути. Она готовит каждый из наборов на основе только одного белка с хорошо известным значением М, сшивая его в димеры, тримеры и далее вплоть до гексамеров обработкой глутаровым альдегидом. Аналогичный подход в свое время был описан и в лабораторной практике (Inouye, 1971]. Кстати, автор цитируемой работы проводил одновременно и дан-зилирование своих маркерных белков, что позволяло ему фиксировать их.положение при УФ-освещении без окраски1 геля.
При определении молекулярной массы коллагена использование глобулярных белков в качестве маркеров возможно, в том случае, если строить график зависимости от расстояния миграции не самой молекулярной массы белка, а длины его полипеп-тидной цепи (логарифма числа аминокислотных остатков). Скорость миграции зависит именно от размера молекулы белка — переход к молекулярной массе предполагает некое среднее ее значение, приходящееся на один остаток. Между тем, в состав коллагенов входит необычно много легких аминокислот: глицина, аланина, пролина [Noelken et al., 1981].
Окрашивание и элюция белков
Эти вопросы рассмотрены ниже в специальных параграфах, но все же имеет смысл несколько замечаний, связанных с использованием ДДС-Na, сделать именно, здесь
После электрофореза в присутствии ДДС-Na гель окрашивают, как обычно, например, в 0,25%-ном растворе СВВ R-250. (см. ниже) в 9%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение нескольких часов при комнатной температуре, а затем отмывают в 7,5%-ной уксусной кислоте с 5% метанола и добавкой ионообменника AG 501x8 для связывания красителя. Фиксация белков идет одновременно с их окрашиванием. Однако следует иметь в виду, что ДДС-Na является эффективным детергентом и препятствует осаждению, а следовательно, и фиксации белков. Для., малых белков фиксация при окрашивании может оказаться ненадежной. Их лучше фиксировать предварительно, вымачивая гель в 10%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). ДДС-Na, находясь в комплексе с белком, еще и препятствует в некоторой мере самому процессу окрашивания. 10%-ная ТХУ частично отмывает белок от ДДС-Na. Еще лучше это можно делать, вымачивая гель в 50%-ном растворе ТХУ (в течение ночи). Изопропанол ускоряет вымывание ДДС-Na, поэтому его целесообразно включить в фиксирующий белки раствор.
Можно окрашивать белки в геле, вымачивая его прямо в 0,05%-ном растворе СВВ R-250 в 10%-ной ТХУ. Краситель до-
вольно плохо растворим в ТХУ, поэтому происходит его распределение между жидкой фазой и белками в пользу последних. Белковые полосы проявляются очень быстро, и гель можно от красителя не отмывать. Однако чувствительность окраски несколько снижена по сравнению со стандартной процедурой. Ниже будут оценены возможности повышения ее чувствительности с помощью таких флюоресцентных красителей, как данзилхло-рид, флюоресцамин, ортофталевый альдегид и др. Здесь уместно отметить, что их присоединение к белкам исходного препарата не влияет на электрофоретическую подвижность этих белков.
Белок из неокрашенного геля можно извлекать одним из подробно рассмотренных ниже способов, в частности повторной элюцией-из кусочков геля встряхиванием в течение б—12 ч при 37° с четырехкратным объемом 0,01 М бикарбоната аммония с 0,1% ДДС-Na. Объединенные элюаты лиофилизируют, удаляя бикарбонат, и растворяют, в воде до 0,1 исходного объема. Затем для удаления ДДС-Na добавляют 9 объемов (по отношению к воде) ацетона, лучше подкисленного, так как в нем хорошо растворяется ДДС-Na. Белок осаждают центрифугированием и промывают 90%-ным ацетоном. В случае необходимости более полного освобождения белков от ДДС-Na лиофилизированный, как указано выше, элюат из геля растворяют снова в 0,1 объема, но не воды, а 0,05 М раствора бикарбоната' аммония с 6 М мочевиной (для предотвращения неспецифической сорбции белка на смоле). Раствор пропускают через микроколонку с Do-wex 1x2 (200—400 МЕШ), уравновешенную тем же буфером. Мочевину затем удаляют диализом.
Электрофорез белкОв в комплексе с ДДС-Na сейчас в подавляющем большинстве случаев ведут в системе, предложенной. Лэммли [Laemmli, 1970]. В этой системе обработка белка ДДС-Na совмещена с использованием описанной ниже схемы, ступенчатого электрофореза. Такое усложнение не кажется, всегда оправданным, поскольку достаточно хорошее сужение исходной белковой полосы можно получить просто за счет разбавления буфера, в котором вносится препарат. Больший интерес, по-видимому, представляет сочетание обработки белка ДДС-Na с использованием градиента пористости геля. Этот прием будет рассмотрен ниже.
