Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Гамильтон [Hamilton, 1974] при разделении рибосомальных белков по заряду в первом направлении использовал ступенчатый электрофорез в кислом буфере (7,5%-ный ПААГ с pH 4,6 — в рабочем геле, 2,5%-ный ПААГ с pH 6,5 — в формирующем). Во втором направлении он вел разделение белков в комплексе с ДДС-Na в 15%-ном ПААГ. Обработку детергентом он осуществлял, вымачивая извлеченный из трубки гель первого направления в 1%-ном растворе детергента. В работе были определены молекулярные массы рибосомальных белков (путем сравнения с маркерами во втором направлении) и оценены их количественные соотношения в составе малой субъединицы рибосом печени крысы.
Интересный подход к фракционированию рибосомальных белков был использован в недавней работе [Hoffman, Dowben, 1978Ь]. При разделении в первом направлении авторы использовали различие в протяженности гидрофобных участков поверхности у разных белков рибосомы. Оно проявлялось в степени связывания этих белков с мицеллами Тритона Х-100, который вводили при полимеризации геля до концентрации 0,15%. Комплексы белков с Тритоном Х-100 разделяли по размеру в 8%-ном ПААГ в присутствии 2 М мочевины. Концентрация детергента была оптимальной; при меньших концентрациях он мало влияет на подвижность белков, а при больших, как уже отмечалось, препятствует последующей обработке ДДС-Na, который в этой работе использовали при фракционировании белков во втором направлении. Подробнее об использовании Тритона Х-100 в этих целях будет сказано в следующем разделе.
В качестве лидирующего красителя при фракционировании рибосомальных белков в кислом буфере недавно было предложено использовать FeCla. Ионы Fes+ в присутствии уксусной кислоты образуют стойкие комплексы коричневого цвета, мигрирующие к катоду впереди самого мелкого из рибосомальных белков [Bernabeu et al., 1979].
Рис. 25. Сочетание хроматографии с электрофорезом в геле агарозы [Bloom, Anderson, 1979]
/ — хроматографическая колонка; 2 — обессоливание в «биофибрах», 3 — перистальтический насос; 4 — раствор агарозы; 5 — нагреватели; 6 — трубка для электрофореза; 7 — охлаждающая смесь
Рис. 26. Разделение гистонов сочетанием хроматографии на оксиапатите (направление I) и электрофореза в градиенте концентрации ПААГ (направление И) в присутствии ДДС-Na [Bloom, Anderson, 1979]
Двумерным электрофорезом часто разделяют и другие щелочные белки. Например, факторы инициации белкового синтеза из ретикулоцитов образуют много пятен при фракционировании каждого из них в первом направлении по заряду в кислой мочевине, а во втором — по размерам ступенчатым электрофорезом в системе Лэммли [Floyd et al., 1979].
Двумерный электрофорез белков хроматина описан Бакаевым и соавторами [Bakayev et al., 1978]. В первом направлении хроматин после обработки его микрококковой нуклеазой фракционировали в 5%-ном ПААГ и буфере низкой ионной силы (0,01 М ТЭА-НС1, pH 7,6) на олиго-, моно- и субнуклеосомы за счет заряда входящей в их состав ДНК, как это было описано выше. Во втором направлении авторы использовали в одном случае фракционирование белков хроматина по размеру в системе Лэммли после вымачивания геля первого направления в 1%-ном растворе ДДС-Na. Детергент обеспечивал и диссоциацию белков от ДНК. В другом варианте разделения диссоциацию осуществляли с помощью цетавлона, а электрофорез во втором направлении вели в кислой мочевине. Во втором варианте хорошо выявлялась группа быстро мигрирующих негистоно-вых белков хроматина (HMG-белков). Для анализа этих белков авторы экстрагировали их 0,35 М раствором NaCl, очищали осаждением ТХУ (2—l20%) и разделяли двумерным электрофорезом, причем в первом направлении использовали фракционирование по заряду в кислой мочевине, а во втором—разделение по размерам в 15%-ном ПААГ после обработки ДДС-Na.
Двумерный электрофорез субъединиц различных РНК-поли-мераз в уже цитированной работе д’Алессио и соавторов проводили в двух вариантах разделения белков по заряду в первом направлении. В обоих вариантах использовали ступенчатую систему электрофореза: в одном — с кислым буфером (pH 4,3) для рабочего геля, в другом —со щелочным (pH 9,4). Во втором направлении в обоих случаях белки фракционировали по их размерам после обработки ДДС-Na в системе Лэммли [d’Alessio et al., 1979].
Мы не случайно в качестве примеров двумерного электрофореза рассмотрели только случаи фракционирования щелочных белков. Для кислых белков все другие варианты двумерного фракционирования вытеснила уже упоминавшаяся система О’Фарелла. Щелочные белки до последнего времени плохо разделялись в этой системе, однако недавно была предложена ее модификация, позволяющая успешно вести разделение и щелочных белков.
Блум и Андерсон предложили оригинальный метод двумерного разделения белков [Bloom, Anderson, 1979]. Собственно, электрофорез в нем используется только во втором направлении. Фракционирование белков в первом «направлении» осуществляется на хроматографической колонке (рис. 25). Элюат с колонки обессоливают, пропуская его через «биофибры», погруженные в 10%-ный раствор ДДС-Na с 1% [}-меркаптоэтанола. Затем его подогревают до 96° и по каплям смешивают с раствором расплавленной при такой же темлературе агарозы. Оба раствора подают одним двухканальным перистальтическим насосом, и горячая смесь постепенно заполняет погруженную в лед трубку. Таким образом, в трубке полимеризуется элюат с хроматографической колонки, т. е. по длине геля располагаются белковые зоны в той последовательности, как они выходят из колонки. Затем гель извлекают из трубки и накладывают на пластину ПААГ, заливают расплавленной агарозой и ведут электрофорез в системе Лэммли. В частности, авторы элюировали гистоны с колонки оксиапатита линейным градиентом концентрации NaCl (0—1,5 М) в 1 мМ Na-фосфэтном буфере (pH 6) с 6 М мочевиной. Гистоны выходили, не разделившись, а лишь растянувшись по элюату. Во втором направлении использовали электрофорез в присутствии ДДС-Na в градиенте пористости ПААГ (8—(25%). На пластине гистоны оказались прекрасно отделенными друг от друга (рис. 26). В частности, гистоны Н2А и Н2В далеко отошли от НЗ благодаря значительному различию в их сродстве к оксиапатиту.
