Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
704
Глава 9
ление происходит именно с этой стороны молекулы; восстановительный
эквивалент переносится к атому железа по цепочке остатков, связанных друг
с другом водородными связями. Согласно имеющимся данным, этими остатками
являются Ser-89, Туг-52, Туг-70 и Met-91. В отличие от цитохрома с
окисление происходит по тому же пути, но в обратной последовательности.
Цитохромоксидаза
Цитохром аа3 (цитохром с-оксидаза, КФ 1.9.3.1) осуществляет быстрое
окисление восстановленного цитохрома с молекулярным 02; в отсутствие
этого фермента реакция протекает очень медленно. Цитохром аа3 является
"терминальной" окси-дазой главной дыхательной цепи митохондрий, он
локализован во внутренней мембране митохондрий, с которой относительно
прочно связан. Цитохром аа3 может быть солюбилизирован детергентами, при
этом его получают в диспергированном состоянии; дальнейшую очистку
осуществляют путем'фракционирования в присутствии детергентов. В
диспергированном состоянии оказываются также липиды из мембран и
субъединицы различных белков; молекула оксидазы содержит два атома Си и
две группы гема типа а. Удается выделить, однако, только один тип гема.
Гемовые группы несколько различаются по скорости реакций окисления и
восстановления, взаимодействию с ингибиторами и по спектральным
характеристикам, поэтому можно полагать, что они связаны с белком
различным образом. Эти гемы получили названия: "гем а" и "гем а3", отсюда
и название
"ЦИТОХрОМ ?Шз".
Цитохром с-оксидаза, находящаяся во внутренней мембране митохондрий
сердечной мышцы быка, содержит шесть разных белковых субъединиц, которые
получили номера от I до VI (не путать с комплексами I-IV митохондриальной
дыхательной цепи, рассматриваемыми ниже). Гомогенные препараты шести
белковых субъединиц были выделены методом электрофореза в
полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия [558]. Они обладают
гидрофобными свойствами; определены их молекулярные массы и
аминокислотный состав. Значения молекулярных масс, найденные разными
авторами, различаются на несколько процентов; согласно последним данным
[1294] они равны: 1 - 40000, 11 - 22500, III- 15 000, IV- 11 200, V
-
9 800, VI - 7 300, так что самые мелкие субъединицы можно рассматривать
как полипептиды.
В цитохромоксидазе из дрожжей и Neurospora, вероятно, имеется не шесть, а
семь субъединиц, из которых три самые большие весьма гидрофобны и
синтезируются на митохондриальных рибосомах; другие четыре субъединицы
более гидро-
Кофакторы ферментов
705
Рис. 9.20. Схема асимметричной упаковки субъединиц цитохром с-оксидазы во
внутренней мембране митохондрий сердца быка [1294]. Размер и форма
различных субъединиц (или групп субъединиц) выбраны произвольно.
фильны и синтезируются на цитоплазматических рибосомах [4112].
В работе Рэкера [1294] приведены данные об относительном: расположении
субъединиц оксидазы из сердечной мышцы быка^ полученные путем обработки
мембраносвязанной оксидазы диазобензолсульфонатом, меченным изотопами.
Этот реагент взаимодействует с белками неспецифично, однако не может
проникнуть в глубь мембраны. Полученные результаты показаны на рис. 9.20.
Внутренняя мембрана на рисунке заштрихована; ее нижняя поверхность (М-
сторона) находится в контакте с матриксом или внутренней областью
митохондрии, а верхняя сторона (С-сторона) контактирует с пространством,
расположенным между внутренней и внешней мембранами, т. е. с областью, из
которой восстановленный цитохром с подходит к оксидазе. В предшествующих
работах было показано, что область, в которой происходит связывание с
лигандами, конкурирующими с кислородом, такими, как СО и азид, находится
на М-стороне внутренней мембраны. .
С помощью весьма остроумных приемов оказалось возможным избирательно
обрабатывать препараты диазореагентом либо с С-стороны, либо с М-стороны.
После этого субъединицы разделяли и определяли метки на каждой из них.
Когда реагент действовал на С-сторону (на интактных митохондриях), то
существенное количество метки обнаруживалось только в субъединицах II, V
и VI, если же он действовал на М-сторону, то метилась субъединица III. Ни
в одном случае не было обнаружено' метки в субъединицах I или IV, что
указывает на недоступность этих субъединиц для диазореагента. При
использовании препаратов очищенной оксидазы метка была обнаружена в
субъединицах II, III, V и VI, но не в I и IV; если фермент перед
обработкой диазореагентом подвергался действию додецилсульфата натрия, то
все шесть субъединиц оказывались мечеными.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что расположение оксидазы в
мембране примерно соответствует схеме, пред-
706
Г лава 9
ставленной на рис. 9.20; оксидаза образует асимметричный мостик между
двумя сторонами мембраны. Ко времени написания книги положение гемовых
групп и атомов меди в структуре оксидазы еще не было установлено, однако
имеются данные, которые позволяют предполагать, что гем а3 находится на
М-стороне, а гем а, который, как следует из кинетических данных, первым
