Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
4.4. Связывающие белки плазмы
Стеооидные и тиреоидные гормоны находятся в крови в виде комплексов со специфическими белками: глобулин, связывающий кортизол, служит комплексообразоватблем для
кортикостероидов и прогестерона, глобулин, связывающий половые гормоны, образует комплексы с эстрогенами и андрогенами, а глобулин, связывающий тироксин, образует комплексы с тироксином и трннодтнронином. Благодаря присутствию этих белков основная масса активного гормона находится в крови в связанной форме; свободной остается лишь небольшая часть гормона, которая ответственна за его биологическую активность.
Связывающие белки плазмы нашли широкое применение в качестве связывающих агентов для анализа соответствующих лигандов; преимущество этих связывающих агентов состоит в том, что исходный материал воспроизводим и легко доступен. Впервые такие методы были описаны для тироксина (Ekins, 1960) и кортизола (Murphy et al., 1963). Обычно в качестве источника исходного материала используют сыворотку, которую берут у женщин на поздних стадиях беременности и в которой все указанные выше связывающие белки присутствуют в высоких концентрациях. Вместе с тем методы анализа подобного типа имеют ряд указанных ниже недостатков, из-за которых в настоящее время они почти полностью вытеснены радноиммунологическнми методами. 1) Связывающие белки крови характеризуются низкими по сравнению с антителами константами сродства (107—10® л/моль), в связи с чем нельзя создать высокочувствительный метод анализа.
2) Специфичность этих белков невысока; так, например, ГСПГ способен связывать очень многие эстрогены и 17-оксн-андрогены, из-за чего для анализа какого-либо одного из этих соединений приходится проводить предварительную экстракцию и очистку. 3) Константа сродства связывающих белков сильно зависит от температуры, в связи с чем анализ приходится проводить при низкой температуре и в условиях строгого ее контроля. 4) Из-за низкой константы сродства приходится использовать высокие концентрации связывающего агента, что требует большого количества материала, тогда как количества антнсывороткн, полученной от одного животного, может хватить, как это указывалось выше, на многие миллионы анализов.
4.5. Иммунорадиометрический метод анализа эндогенных антител и связывающих белков крови
Радиоиммунологическнй и сходные с ним методы анализа * используются в основном для определения концентрации лиганда в образцах биологических жидкостей. Однако эти принципы могут быть применены также для измерения концен-
трации эндогенного связывающего агента в образце, например для прямого определения природных связывающих белков плазмы, в частности таких, как ГСПГ или ГСТ. Этот же принцип может быть использован для определения содержания антител в крови больных при лечении их кортикотропином, питрессином, гормоном роста или инсулином, а также для обнаружения специфических антител IgE у больных с аллергическими нарушениями или для определения количества рецепторов стероидных гормонов в опухолях молочных желез.
Подходы, которые используются при анализах подобного рода, можно проиллюстрировать на следующих примерах: 1) Определение количества глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ). Связывающие места ГСПГ в этом случае насыщают [3Н]5а-дигидротестостероном ([3Н]5а-ДГТ), затем избирательно осаждают ГСПГ сульфатом аммония и по количеству связанного с ним [3Н]5а-ДГТ определяют концентрацию ГСПГ (Rosner, 1972). 5а-ДГТ используется в качестве лиганда вместо тестостерона в связи с тем, что он обладает ббльшим сродством к ГСПГ. 2) Определение содержания ГСТ. Связывающие участки ГСТ, не занятые тироксином (Т4), насыщают трииодтиронином (Т3), меченным изотопом 1251. Затем свободный и связанный Тз разделяют при помощи одного из нескольких известных способов, чаще всего путем адсорбции свободного Т3 на смоле (Mitchell et al., 1960). В данном случае меченый лиганд (Т3) обладает более низким сродством к связывающему белку по сравнению с эндогенным лигандом (Т4). В связи с тем что результат анализа зависит как от количества ГСТ, так и от общего количества Т*, проводят параллельно прямое определение количества Т4 и получают таким образом «индекс свободного тироксина». Описанный метод анализа широко применяется для исследования функциональной активности щитовидной железы и имеет несколько названий, в том числе «тест на поглощение тиреоид-ного гормона», «тест с поглощением Т3 смолой». 3) Определение количества антител, специфичных по отношению к СТГ. У детей-карликов при длительном лечении очищенным гормоном роста человека нередко образуются антитела, специфичные по отношению к этому гормону. Эти антитела можно обнаружить и определить их количество при помощи метода связывания с использованием в качестве меченого лиганда СТГ человека, меченный изотопом 1251, а также сыворотки больных в серийном разведении; для разделения свободного и связанного СТГ применяются другие антитела, специфичные по отношению к иммуноглобулинам человека (см. разд. 5.3.5.1). 4) Определение специфических антител IgE. Аллергические нарушения (такие, как, например, сенная лихорадка или астма) связывают с присутствием эндогенных
