Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
5. Сливают оба раствора и перемешивают в течение 24 ч при 4°С
6. Реакционную смесь подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 36 ч
7. Лиофилизуют раствор, остающийся в диализном мешочке (конъюгат)
Примечание. Существует много различных способов приготовления конъюгатов гаптенов с белком. Более детальное описание этих способов можно найти в работе Эрлангера (Erlanger, 1973).
Рис. 4.3. Молекула эстраднола; стрелками показаны участки, которыми она может связываться с молекулами белка в процессе образования иммуногеиа. Наиболее предпочтительны конъюгаты, в которых связь осуществляется через 6-е положение, поскольку при этом остается открытым большинство специфических участков молекулы, необходимых для проявления биологической активности.
гаптен отделен от носителя промежуточной группой, включающей 4—6 атомов углерода. В продаже имеются в готовом виде производные эстрогенов, которые можно непосредственно использовать для связывания с белками (например, эст-риол-6-карбоксиметилоксим, Steraloids Inc.). Одна из методик связывания гаптена с белком приведена в качестве примера в табл. 4.3.
Далеко не все комплексы гаптенов с белками являются одинаково хорошими иммуногенами. Так, например, сравнительно легко можно получить антисыворотку к простагланди-нам групп А и F, тогда как получение антисыворотки к про-стагландинам группы Е сопряжено со значительными трудностями.
4.2.9. Использование адъюванта
В подавляющем большинстве схем иммунизации рекомендуется вводить антиген в виде эмульсии, которая носит назва-ние «полный адъювант Фрейнда». Эта эмульсия представляет собой смесь минерального масла, детергента и убитых микобактерий (при отсутствии последних адъювант называют неполным). Первоначальная цель использования адъюванта Фрейнда состояла в том, чтобы замедлить всасывание вещества, которое при введении в виде единичной большой дозы могло бы оказаться токсичным (например, инсулин). Роль отдельных компонентов, входящих в адъювант, в иммунном ответе состоит в следующем. Минеральное масло, являясь веществом гидрофобной природы, задерживается в месте введения и замедляет таким образом процесс всасывания; капельки масла постепенно поглощаются макрофагами рети-кулоэндотелиальной системы, в результате чего содержащийся в них антиген освобождается в режиме, при котором обеспечивается его максимальный контакт с иммунной системой. Детергент служит в качестве эмульгатора, благодаря которому антиген сосредотачивается внутри капель в водном растворе (рис. 4.4). Эмульсия «вода в масле» является в этом смысле более эффективной, чем эмульсия «масло в воде»; чтобы добиться ее образования, объем адъюванта должен по меньшей мере в два раза превышать объем раствора антигена; полученную эмульсию проверяют, нанося на поверхность воды. Что касается убитых микобактерий, то они вво-
„ вода & масле " мяся* в
Рис. 4,4. Два типа эмульсии, которые могут образовываться при гомогенизации иммуио-геиа в полном адъюванте Фрейнда. Желательно иметь эмульсию воды в масле, и с этой целью необходимо испольэовать избыточный объем адъюванта.
4 Т, Чард
дятся для того, чтобы вызвать общую (неспецифическую) стимуляцию ретикулоэндотелиальной и иммунной систем, сопровождаемую местной и системной пролиферацией макрофагов и лимфоцитов. Некоторые исследователи предварительно вводят с этой целью убитые туберкулезные палочки.
4.2.10. Виды животных
Лишь в немногих случаях были обнаружены четкие видовые различия между животными в отношении ответа на тот или иной антиген. Иногда подобные различия обнаруживаются у инбредных линий; так, например, было показано, что одна линия морских свинок не отвечает на динитрофенол (Green et al., 1969). Однако этот факт является скорее исключением, чем правилом, и выбор животных зависит обычно от соотношения между имеющимися возможностями и предполагаемой потребностью в антисыворотке. При прочих равных условиях предпочтительно использовать более крупных животных, таких, как коза, осел или лошадь; если удается получить от таких животных хорошую антисыворотку, то ее можно иметь в значительном количестве (1 л или даже больше). Многие лаборатории, однако, не располагают помещениями для содержания крупных животных, хотя могут содержать достаточное количество мелких животных, таких, как кролики или морские свинки. Именно этой причиной можно объяснить широкое использование кроликов и морских свииок при получении антисывороток для радиоиммунологического анализа. Однако при наличии антисывороток с высоким титром и большим сродством к лиганду небольшого объема этих сывороток может оказаться достаточно для огромного числа анализов, в связи с чем количество антисыворотки не является, как правило, главным критерием.
4.2.11. Споооб иммунизации
Иммунный ответ носит системный, а не местный характер, в связи с чем при различных способах иммунизации получают относительно сходные результаты. Тем не менее в литературе можно встретить немало высказываний о преимуществах того или иного способа введения. 1) Внутрикожное введение; при таком способе введения в одно место можно вводить очень небольшой объем иммуиогена (около 25 мкл). В работе Ватю-кайтис и др. (Vaitukaitis et al., 1971) описан способ, при котором эмульсию иммуногена вводят по меньшей мере в 40 точек, расположенных по всей поверхности тела. Такой способ введения позволяет получать быстрый и почти максимальный иммунный ответ уже после однократной иммунизации и дает
