Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Метод Источник данных
Электрофорез (крахмальный гель, Hunter, Greenwood, 1964
ацетат целлюлозы, полиакриламид Haber et al., 1965
ный гель) Herbert et al., 1965;
Гель-фильтрация (колонки или до Rosselin et al., 1969;
бавление в пробирку) Trafford et al., 1974
Адсорбция (активированный уголь, Grodsky, Forsham, 1960;
силикаты, гидроксилапатит) Heding, 1966;
Фракционное осаждение (этано Thomas, Ferrin, 1968;
лом, диоксаном, полиэтиленгликолем, Chard et al., 1971;
сульфитом натрия, сульфатом ам Desbuquois, Aurbach 1971}
мония, трихлоруксусной кислотой) Mitchell, Byron, 1971
Метод двойных антител (раствори Utiger et al., 1962;
мая и твердая фазы) Hales, Randle, 1963;
Иммобилизованные антитела (на Morgan, Lozarow 1963-.
полимерных частицах, на стенках Hollander, Schuurs, 1971
пробирок, включение в гель, полиме- Wide, Porath, 1966;
ризованные антитела) Catt, Tregear, 1967;
Donini, Donini, 1969;
Updike et al., 1973
5.3.1. Электрофорез
Первым методом, примененным для разделения компонентов реакционной смеси в радиоиммунологическом методе анализа, был метод хроматоэлектрофореза на бумаге. Этот метод возник непосредственно на базе методов, изначально применявшихся для идентификаций антител к инсулину в сыворотке больных (Berson et al., 1956), и впервые был использован для определения инсулина (Yalow, Berson, 1960). Применение метода хроматоэлектрофореза для разделения свободного и связанного гормона основано на том, что свободный гормон адсорбируется на бумаге в точке нанесения, тогда как гормон, связанный с антителами, движется к центру бу-мажной полоски. После высушивания электрофореграммы можно измерить радиоактивность отдельных ее участков и таким образом определить соотношение радиоактивности в свободном. и связанном гормоне. Однако с практической точки зрения метод хроматоэлектрофореза имеет много недостат-Ков, поэтому в настоящее время используется редко,
Для разделения можно использовать другие виды элект-рофореза, в том числе электрофорез в крахмальном или поли-акриламидном геле или в ацетате целлюлозы, однако все эти методы также обладают определенными недостатками.
Очевидно, что молекула комплекса, состоящего из связы* вающего агента и лиганда, должна иметь более крупные раз-меры, чем молекула самого лиганда. В радиоиммунологиче-ском методе анализа используются антитела, молекулярный вес которых составляет 160 000. Молекулярный же вес анти-генов в большинстве случаев не превышает 50 000, и, следо-вательно, молекулы комплекса антиген — антитело имеют значительно больший размер, чем молекулы антигена. Ука« занное обстоятельство позволяет проводить хроматографи-ческое разделение при помощи метода, основанного на принципе молекулярного сита, с применением таких материалов, как сефадекс и биогель. При этом используют один из двух приемов. В первом из них гель применяется в виде колонок; для стандартных анализов подобный способ, несомненно, ЯВ' ляется слишком сложным и трудоемким, даже если одновре-менно используется много колонок, изготовленных из шпри' цов или стеклянных трубочек (Giese, Nielsen, 1971), в связи с чем его применяют только для контроля. В практическом отношении значительно больше подходит другой прием, при котором гель добавляют прямо в инкубационную смесь (рис. 5.2); в этих условиях низкомолекулярные соединения свободно распределяются между внутренним пространством гранул и внешней средой, а соединения с более высоким молекулярным весом (комплекс, состоящий из связывающего агента и лиганда) не могут проникнуть в гранулы и концент»
5.3.2. Гель-фильтрация
О** С)» • Г\
О • oVq
CeoSbffm/f} ляган#
Рис. 6.2. Разделение при помогай пористого геля. Свободный лиганд может проникать в гранулы геля и распределяться таким образом между ними и жидкой фазой. Связанный лигрнд имеет более высокий молекулярный вес и не проникает в гранулы.
рируются в окружающей их среде. В действительности механизм, по-видимому, сложнее, поскольку многие лиганды в свободном виде могут специфически связываться с матрицей геля. Разделение, основанное на прямом добавлении геля или аналогичного материала, используется в коммерческих наборах, предназначенных для радиоиммунологического анализа тиреоидных гормонов.
5.3.3. Методы адсорбции
Для разделения свободного и связанного лиганда широко применяется неспецифическая адсорбция биологических молекул на поверхности частиц. Большинство методов этого типа основано на том, что адсорбироваться могут только молекулы свободного лиганда, а молекулы связывающего агента и его комплекса такой способностью не обладают (рис. 5.3). Механизм адсорбции будет рассмотрен более детально в следующей главе. Адсорбционные методы хотя и полностью отвечают требованиям, предъявляемым к методам разделения (скорость, простота и небольшая стоимость), однако не обладают достаточной эффективностью. При их применении приходится тщательно подбирать условия (pH, температура, ионная сила, концентрация белка), чтобы избежать адсорбции комплекса. Если к тому же комплекс обладает большой скоростью диссоциации, то адсорбент может конкурировать со связывающим агентом за лиганд и вызывать расщепление комплекса (рис. 5.4).
