Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 45

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 100 >> Следующая

Имеет место также неполное отделение связанного лиганда. Можно было бы ожидать, что в присутствии избытка антител будет связываться 100% меченого лиганда, однако на самом деле редко удается добиться такого оптимального варианта, и чаще всего связывается не более 70%. Это может объясняться несколькими причинами. Во-первых, какая-то часть молекул связывающего агента, а следовательно, и его
комплекса с лигандом может вести себя подобно свободному лнганду; так, например, неполное осаждение часто имеет место при использовании в радиоиммунологическом анализе метода двойных антител (см. разд. 5.3.5.1). Во-вторых, меченый лиганд может содержать примеси, которые не реагируют со связывающим агентом и в результате оказываются в свободной фазе (например, свободный иодид). В-третьих, процесс разделения может вызывать диссоциацию комплекса; например, при использовании метода разделения, при котором свободный лиганд адсорбируется на угле, а связанный остается в растворе, разделению может мешать тот факт, что активированный уголь способен конкурировать со связывающим агентом за лиганд и «отрывать» таким образом лиганд от комплекса (см. разд. 5.3.3). Разные причины, препятствующие оптимальному разделению, могут играть, вероятно, неодинаковую роль для различных систем. Поэтому при налаживании нового метода анализа необходимо перепробовать несколько способов разделения.
Среди существующих методов разделения наиболее эффективными (низкая холостая проба и полное отделение связанного лиганда) следует, по-видимому, считать твердофазный метод и метод двойных антител. Однако оба метода имеют ряд недостатков с точки зрения практичности, о которой пойдет речь в следующем разделе.
5.2. Практичность методов разделения
Под этим подразумеваются скорость и простота метода разделения, а также возможность его широкого применения и стоимость (два последние пункта до некоторой степени взаимосвязаны). Большая скорость разделения желательна в связи с тем, что во многих случаях результат, полученный в тот же день, является более ценным для врача, чем тот же результат, полученный на следующий день. Однако большинство методов разделения занимает значительно меньше времени, чем инкубация при проведении основной реакции, в связи с чем процесс разделения лишь в небольшой степени увеличивает общее время анализа. Исключение в этом отношении составляет метод двойных антител, применяемый в радиоиммунологическом анализе, поскольку в этом случае этап разделения может занимать более 24 ч.
Простота метода разделения имеет немаловажное значение, поскольку в значительной мере от нее зависит общее число анализов, которые может провести один сотрудник. Если, например, для разделения приходится проводить определен-
ную обработку каждой пробирки (например, нанесение на хроматографическую пластинку или на электрофореграмму), то общее число пробирок, которое можно обработать за определенный период времени, будет ограничено, а следовательно, пропускная способность будет ниже. Более того, существует прямая зависимость между сложностью методики и воспроизводимостью. К счастью большинство существующих в настоящее время методов разделения сводится к простому добавлению одного реагента, перемешиванию, центрифугированию и измерению радиоактивности в осадке или в надосадоч-ной жидкости; с точки зрения удобства лучше измерять радиоактивность в осадке, поскольку его не нужно количественно переносить из пробирки, в которой проводился анализ. Единственным методом, включающим дополнительные этапы, кроме перечисленных, является использование твердофазных иммуносорбентов, когда для получения оптимальных результатов приходится проводить повторные промывания.
Универсальность ‘ метода разделения, т. е. возможность его использования в различных методах анализа, хотя и желательна, но не столь уж существенна. Более всего отвечают этому требованию методы, в которых используются двойные антитела или иммобилизованные связывающие агенты; в принципе эти методы являются универсальными и могут быть использованы для разделения в любой системе связывающий агент — лиганд.
Стоимость радиоиммунологического метода анализа зависит главным образом от количества затрачиваемого труда и лишь в сравнительно небольшой степени — от стоимости реагентов и основного оборудования. Тем не менее стоимость методов разделения широко варьирует, и при прочих равных условиях ее необходимо учитывать при налаживании метода анализа. Наиболее дешевыми являются те системы, в которых применяется простое добавление органического растворителя (например, этанола), а наиболее дорогими — те, которые требуют больших затрат труда (хроматография, электрофорез) или значительных усилий для приготовления реагентов (твердофазные системы, двойные антитела).
5.3. Методы разделения свободного и связанного лиганда
Отдельные методы разделения даются в классификации, предложенной Ратклифом (Ratcliffe, 1974), и обсуждаются в порядке, указанном в табл. 5.1.
Таблица 5.1
Способы разделения свободного и связанного лиганда, применяемые в методах связывания
Предыдущая << 1 .. 39 40 41 42 43 44 < 45 > 46 47 48 49 50 51 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed