Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
Если иммуноген идентичен или близко напоминает вещество, присутствующее в организме животного-реципиента, образующиеся антитела могут реагировать с этим веществом в крови и в местах его образования и давать описанный выше (разд. 4.2.3) биологический эффект. С практической точки зрения важное значение имеет тот факт, что подобное явление может изменять наблюдаемые характеристики антисыворотки. Эндогенный антиген будет связываться с антителами, обладающими более высоким сродством; если константа диссоциации окажется низкой, то процесс будет практически необратимым, и при тестировании антисыворотки будет создаваться впечатление, что она обладает относительно низким средством. В тех случаях, когда может наблюдаться подобное явление, тестирование антисыворотки целесообразно проводить как до, так и после обработки (в ходе которой проводилось бы расщепление комплекса антиген — антитело с помощью, например, кислоты или хаотропных агентов типа мочевины),
а затем отделять свободный антиген от антитела (например, с помощью диализа или гель-фильтрации). Недостаток такого приема заключается в том, . что используемые химические агенты могут вызывать повреждение антител.
4.2.8. Использование гаптонов в качестве иммуногенев
Для приготовления иммуногенов из небольших молекул в качестве носителей чаще всего используют белки типа альбумина. В этих случаях необходимо, чтобы между двумя компонентами образовалась ковалецтная связь; как правило, ею является пептидная связь, возникающая в результате взаимодействия карбоксильной группы гаптена со свободной аминогруппой белковой молекулы (в основном за счет аминогруппы боковой цепи остатка лизина). Если, однако, меньшая молекула не содержит карбоксильную группу или аминогруппу, то приходится получать производные, содержащие такие активные группы. Примеры таких производных приведены в табл. 4.2.
Таблица 42
Примеры производных, при помощи которых можно связывать небольшие молекулы гаптеиов, ие содержащих амино- или карбоксильные группы, с аминогруппами белков.
(Для знакомства с принципами и методами получения конъюгатов белок—гаптеи см. Erlanger, 1973)
Активные группы небольшой молекулы Производные» содержащие
карбоксильные группы
Кето-группа Карбоксиметнлоксим
Гидроксильная группа Сукцииат
Глутарат
Хлоркарбонат
Фенольная группа я-Аминобензоат
Существует множество методов, позволяющих образовать Пептидную связь между гаптеном или его производным и молекулой белка (Erlanger, 1973). Эти методы включают реакции со смешанными ангидридами, а также использование кар-бодиимидов. Недостаток методов, основанных на применении карбодиимидов, состоит в том, что при этом может образоваться большое число ковалентных связей между самими белковыми молекулами.
Число молекул гаптена, которое способна связать белковая молекула, зависит от числа содержащихся в ней свободных аминогрупп. Для молекулы альбумина это число равно 60, причем по меньшей мере 15—30 из них должны связаться с гаптеном для того, чтобы полученный комплекс был эффек-
тельно
группы
тивен в качестве иммуногена. Предлагалось использовать в качестве носителя тироглобулин, в котором имеется не менее 400 мест связывания, однако конкретных доказательств преимущества этого белка по сравнению с альбумином получено не было.
Для получения специфической антисыворотки исключи-важное значение имеет, очевидно, локализация той через которую гаптен связывается с белком. Задача . ' состоит в том, чтобы при-
У готовить иммуноген, в ко-
он тором основные функци-
ональные группы гаптена находились бы на достаточном расстоянии от места связывания и могли поэтому свободно реагировать с иммунной системой животного в неизменном виде. Так, например, в случае эстрогена место связывания не должно находиться в кольце А, имеющем важное функциональное значение (рис. 4.3); специфические антисыворотки к эстрогенам были получены в тех случаях, когда связи осуществлялись через 6-й или 7-й углеродный атом молекулы эстрогена. Наилучшие результаты в смысле сродства получаются в тех случаях, когда
Таблица 4.3
Методика связывания гаптеиа с белком. Приготовление эстриол-6-БСА
(модификация метода Dean et al., 1971)
1. Растворяют 50 мг эстриол-6-карбоксиметилоксима (Steraloids Inc.) в 10 мл диоксана
2. Добавляют 0,1 мл три-к-бутиламина
3 Охлаждают раствор до 10 °С, добавляют 0,02 мл изобутилхлорформиаТа и перемешивают в течение 30 мин
4. Растворяют 100 мг кристаллического БСА (Sigma Chemical Со.) в 10 мл дистиллированной воды; предварительно pH воды доводят до 9,0 при помощи 2 М NaOH
