Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
5.3.4. Фракционное осаждение
Осаждение солями или органическими растворителями относится к числу самых первых способов фракционирования органических мелекул. В настоящее время этот способ продолжают широко использовать в радиоиммунологических и родственных ему методах анализа для разделения связанного и свободного лиганда, и в тех случаях, когда этот способ оказывается эффективным, он обладает большими практическими преимуществами. Принцип метода прост. После завершения первичной реакции между связывающим агентом и лигандом добавляют применяемый для разделения реагент в концентрации, при которой связывающий агент и его комплекс с лигандом становятся нерастворимыми и выпадают в осадок, а свободный лиганд остается в растворе. Осадок отделяют при помощи центрифугирования и затем измеряют радиоактивность в осадке (связанная фаза) или в надоса-дочной жидкости (свободная фаза).
В принципе механизм фракционного осаждения основан на использовании солей и растворителей, уменьшающих количество свободной воды, т. е. той воды, которая может быть использована для гидратации присутствующих в растворе молекул и благодаря которой последние могут оставаться в растворе (рис. 5.5). Способностью связывать воду, в результате чего она не может быть использована для гидратации других молекул, обладает, например, сульфат аммония. Будет ли вещество оставаться в растворе при данной концентрации агента, используемого для разделения, зави-
СТО
Ришолвкула
Молеяулы во for
Молекула разделяющего агента
Рис. S.S. Механизм осаждения комплекса аитнгеи^-антитело сульфатом аммония. Сульфат аммоиня захватывает молекулы воды, в результате чего последние ие могут быть использованы для образования гидратной оболочки молекулы белка.
сульфата аммония, М
Pm- к й Опыт показывающий эффективность метода фракционного осаждения при количественном Определении окситоцнна (/), АКТГ (II) н инсулина (III) В случае окентопина имеет место значительный разрыв между той концентрацией сульфата аммония. которая необходима для осаждения комплекса антиген-антитело, н той, при кптопой осаждается свободный антиген (холостая проба). В случае нисулииа, напротив, нет никакого разрыва, в связи с чем такой способ разделения ие может быть нсполь зовав для анализа инсулина.
сит в каждом случае от способности этого вещества удерживать молекулы воды; для большинства молекул биологического происхождения эта способность определяется электростатическим зарядом, который в свою очередь зависит от изоэлектрической точки молекулы и от pH среды; чем больше разница между этими величинами, тем больше суммарный заряд молекулы и ее способность создавать гидратную оболочку. Анализы проводятся при нейтральном или близком к нейтральному значении pH; по мере повышения концентрации соли или органического растворителя первыми будут выпадать в осадок вещества, у которых изоэлектриче-ская точка лежит в нейтральной области, а уже затем будут осаждаться другие вещества в порядке удаления их изоэлектрической точки от нейтральной области. Характер фракционирования в данном случае очень сходен с тем, который дает электрофорез при тех же значениях pH: первыми осаждаются молекулы, которые и при электрофорезе движутся наиболее медленно (т. е. молекулы, обладающие наименьшим суммарным зарядом). Относительно гидрофобные молекулы (например, неконъюгированные стероидные гормоны и некоторые лекарственные препараты) остаются в растворе даже при очень высоких концентрациях указанных агентов.
Молекулы антител относятся к гамма-глобулинам, которые при нейтральном значении pH обладают лишь небо^Ть-шим зарядом, в связи с чем они осаждаются при низких концентрациях таких реагентов, как сульфат натрия, который первым из реагентов этой группы был использован в радиоиммунологическом методе анализа (Grodsky, Forsham, 1960), сульфат аммония, диоксан и полиэтиленгликоль. При низких концентрациях этих веществ многие антигены остаются в растворе, что создает основу для простого и эффективного способа разделения.
Хотя описанный выше механизм характерен для большинства систем, тем не менее в отдельных случаях могут наблюдаться различия, в связи с чем эффективность реагента, используемого для разделения, следует каждый раз определять экспериментальным путем аналогично тому, как это показано на рис. 5.6. Для некоторых реагентов (сульфат аммония, полиэтиленгликоль), хотя и не для всех (этанол), было показано, что в их присутствии, т. е. в условиях, когда антитело находится в осадке, взаимодействие антигена с антителом может продолжаться. Этот факт можно использовать как основу для создания метода, позволяющего проводить однократное добавление реагентов — смеси меченого лиганда, связывающего агента и реагента, используемого для разделения.
С точки зрения эффективности методов фракционного осаждения главная проблема заключается в том, что для них характерны большие значения холостой пробы (обычно порядка 5—20%). Этот факт нередко объясняют тем, что меченый лиганд физически захватывается осадком, заполняя имеющееся в нем свободное пространство. Однако скорее всего здесь играет роль какой-то другой механизм, поскольку величина холостой пробы не уменьшается при уменьшении объема осадка даже в тех случаях, когда последний сокращается до микроскопических размеров за счет уменьшения количества белков в системе (сыворотки или носителей-глобулинов). Добавление к раствору небольшого количества второго антитела позволяет проводить разделение при более низкой концентрации соответствующего реагента, благодаря чему при той же степени осаждения связанного лиганда величина холостой пробы может уменьшиться.
