Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
значительную экономию времени и иммуногена. Быстрота ответа в данном случае связана, очевидно, с тем, что освобождение небольших количеств антигена из многих участков происходит значительно быстрее, чем освобождение большого объема из одного участка. 2) Подкожное введение; именно этот путь введения иммуногена получил наибольшее распространение. Приблизительно. 1 мл эмульсии делят на 3—4 порции, которые вводят, в разные точки, расположенные на шее. Основной недостаток способа (впрочем, как и всех остальных) состоит в том, что в местах введения могут образовываться абсцессы и изъязвления, правда, последние, имея неприятный вид, по-видимому, не причиняют животным больших страданий. 3) Внутримышечное введение; этот способ введения используется редко. 4) Внутривенное введение; для введения иммуногена с адъювантом этот способ никогда не используется, поскольку адъювант оказывает токсический эффект и может вызвать мгновенную смерть животного. 5) Внутрибрю-шинное введение; этот способ используется редко, поскольку он может приводить к острой местной реакции и перитониту.
6) Внутриузелковое введение; прямое введение эмульсии в лимфатические узлы (Boyd et al., 1967) на первый взгляд кажется очень заманчивым, однако преимущество этого способа по сравнению с другими доказать не удалось (Нигп, Landon, 1971). Способ является сложным в техническом отношении, и процесс введения часто сопровождается смертью животного. 7) Введение в подушечки лап; нет никаких доказательств, что этот способ имеет какие-либо преимущества перед подкожным или внутрикожным введением. В то же время такой способ введения может вызвать у животных ощущение дискомфорта из-за болезненного распухания лап, в связи с чем его лучше не использовать.
4.2.12. Пооледоветельность инъекций и обора антисыворотки
В связи со значительными различиями между животными и с отсутствием специальной информации интервалы введения иммуногена приходится выбирать эмпирическим путем. В табл. 4.1 в качестве примера приведен протокол введения, проверенный на практике. Однако вполне возможно, что более короткие илн более продолжительные интервалы были бы не менее, а возможно, даже и более эффективными. Для выяснения этого вопроса требуется, однако, больше работы, чем затрачивается обычно на все налаживание системы для радиоиммунологического анализа, а полученные результаты ч могут быть использованы только применительно к данному конкретному иммуногену.
Рис. 4.5. Иммунизация пяти кроликов (кривые I — V) конъюгатом эстриола и бычьего сывороточного альбумина. Стрелками показаны дни проведения поддерживающих ииъекцнй; тнтр дается как величина, обратная разведению антисыворотки, при которой связывается 50% аН-эстрнола_. Видно, что после первой поддерживающей инъекции титр резко повышается, а при последующих введениях ответ бывает крайне вариабельным. Черным квадратиком отмечен момент гибели животного. (Данные любезно предоставлены д-ром С. Кошроу.)
Несколько яснее вопрос о том, когда лучше всего собирать антисыворотку; на рис. 4.5 показан типичный ответ на поддерживающие (т. е. повторные) инъекции. Имеются некоторые указания на то, что титр антител, достигнув пика, снижается. Опыт показывает, однако, что при этом возможны большие вариации: у некоторых животных титр сохраняется в течение .месяцев и даже лет и после прекращения поддерживающих инъекций, тогда как у других животных он постепенно падает.
4.2.13. Отбор антисывороток для использования в радиоиммунологическом методе анализа
Иммунизация по описанной выше схеме будет давать ряд антисывороток, из которых следует отобрать одну или несколько для использования в радиоиммунологическом методе анализа. Критериями при таком отборе являются специфичность, сродство и титр.
Специфичность. Специфичность является основным критерием, и если антисыворотка не обладает необходимой специфичностью, она не представляет никакой ценности для анализа независимо от ее сродства и титра,
Рнс. 4.6. А. Теоретические калибровочные кривые, показывающие разную степень связывания лнгаида прн использовании разных аитисывороток, специфичных по отношению к этому лигаиду. Б. График Скэтчарда, построенный на основании калибровочных Кривых» приведенных на рисунке А. Аитнсыворотка f содержит одну популяцию антител с единственной величиной /С, в связи с чем график Скэтчарда имеет вид прямой лиини. Антисыворотка II содержит несколько популяций антител, имеющих разные величины К, в связи с чем график Скэтчарда представляет собой кривую лниию Если задачи анализа требуют максимально возможного наклона кривой в дна* пазоне концентраций связанного лиганда 0—4» то очевидно что значительно лучше,
пользоваться антителом I.
Сродство. Чувствительность метода анализа тесно связана со сродством или величиной К антител (разд. Y.7—1.10); как правило, для использования в анализе отбирают антисыворотку с максимальной величиной К, определяемой по графику Скэтчарда. Это правило применимо даже к тем методам анализа, при которых не требуется максимальной чувствительности (разд. 8.3), поскольку большая величина К позволяет ожидать (хотя и ие гарантирует) быстрого установления равновесия. Гетерогенность кажущихся значений К, обусловливающая тот факт, что график Скэтчарда представляет собой кривую линию вместо прямой, также является важным фактором, так как она может вызывать уменьшение наклона калибровочной кривой (рис. 4.6).
