Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
5.9. Ингибиторы
В этом разделе будет рассмотрено действие на амидгидролазы органических веществ, подавляющих каталитическую активность ферментов. Действие неорганических ионов было рассмотрено в разд.5.3.
5.9.1. Кинетика ингибирования
Все ингибиторы можно разделить на две большие группы - обратимые и необратимые. Первые обычно образуют с ферментом нековалентные связи, и их действие может быть обращено, например, разбавлением смеси или отделением ингибитора гель-фильтрацией. Вторые реагируют с ферментом, образуя ковалентные связи, и их действие такими простыми приемами обратить не удается. Известны, однако, случаи, когда вещество, связывающееся нековалентно, очень трудно отделить от белка и, наоборот, ковалентная связь разрушается достаточно легко.
Обратимый ингибитор может взаимодействовать как со свободным ферментом, так и с фермент-субстратным комплексом (см. обзоры: [1661,2425]):
Е + S •»------- ES ------* Е + Р
аК (24)
* №г
El + S -------- ESI ---------- EI + Р.
аК 1
в '2
Общее выражение для скорости реакции, соответствующее кинетической схеме
(24), будет:
aKt + ршо ------------ [Е] [S]
2 аК. + [I]
I С
К. + [I]
I о
аК ------------------ + [S]
8 аК, + [I] с
(25)
Тип ингибирования определяется численными значениями коэффициентов а и § [2539].
Полное конкурентное ингибирование характеризуется значениями а-»со, причем § не имеет физического смысла. В этом случае уравнение (25) трансформируется в:
?ЛЕ] [S]
2 о с
шо
(1 + --) + [S]
(26)
Определение величины К( чаще всего проводят по методу Диксона [1661], строя зависимость 1/и от [I] при нескольких значениях !Slo, или же из зависимости 1/u-s-1 /[S]о при нескольких значениях Шо (рис.82).
Полное неконкурентное ингибирование (а=1, р=0) описызпется уравнением
Рис.82. Оцределение константы ингибирования методом Лайнуивера и Берка а- неконкурентное торможение; О- конкурентное торможение; 6- торможение смешанного типа
скорости:
fe„/(1 + [II /Я,)[Е1 [S1
2 о I о о
V = ----------------------------. (27)
К + [S]
S о
Значение й( находят теми же способами, что и в' случае конкурентного ингибирования.
Смешанное ингибирование (а и р^1). В этом случае координаты точек пересечения графиков 1 /и-г-1 / [S]о даются выражениями [25391, не зависящими от К{ :
1 1 (3-1
[S1 К а-|
о 8
1 1 а-1
v V енв
max Г
(28)
(29)
Зная Кд и Vmax из опыта в отсутствие ингибитпра, можно найти аир, решая совместно уравнения (28) и (29).
Другой способ, по?Виляющий найти значения а, р и К(, заключается в пре-ооиазовании ’значений к . и?' б уравнении (25) к виду:
cfix ш
1 1 1
+ ----, (30)
Р-1 [1]о е-1
1 0121 1 1
+ -------. (31 )
К'/(К 1) а-1 [I] а-1
m s о
Из этих двух графиков можно найти все три константы.
Ингибирование субстратом было рассмотрено в разд.4.1.6.
Ингибирование продуктом реакции анализируется < >бычно при больших степенях превращения субстрата, когда условие стационарности не соблюдается. Поэтому, для кинетической схемы
*P
E + S <*----¦» ES -----* E + P, E + P ---------EP (32)
используют интегральное выражение для скорости:
ГР1 V К (1 + [S] /й_) [S]
LrJ max в о *Р' о
--- ---------------------------------Ш------------. (33)
t 1 - Ks/Kp t(1 - Я8/Кр) [Slo - [Р]
Строя графики зависимости [РЗ/t от 1/t-lntSWLS^-tP] при разных [S]q и откладывая на вторичном графике обратные величины отсекаемых на оси абсцисс отрезков от [S]o, можно определить величину Кр. Часто ингибирование продуктом изучают как обычное обратимое ингибирование, вводя в реакционную смесь различные количества продукта и измеряя начальные скорости реакции. Анализ схем ингибирования для многосубстратных реакций дан в работе [2540].
