Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Представление о том, что специфичность определяется уменьшением числа вращательных степеней свободы "хорошего" субстрата, т.е. определяется, главным образом энтропией основного состояния [19871, оказалось неправильным. Как было показано [1992,24531, данные, лежащие в основе этих представлений, получены в условиях, когда компоненты буфера (трис) сильно влияют на скорость деацилирования.
Следует отметить, что во многих экспериментах по температурной зависимости кинетических констант наблюдались изломы на графиках Аррениуса [1907, 2452,2457,2461,24621. Такие изломы могут быть обусловлены несколькими причинами [24631: а) сменой определяющей скорость стадии; б) конформационными изменениями фермента; в) температурно-зависимыми изменениями дН или aS.
В первом случае, если реакция идет по обычной для сериновых и цистеиновых протеаз трехстадийной схеме
2?1 . \ Ь3
Е + S --------=* ES -----> ЕА-------> Е + Р_,
переход от определяющей скорость стадии ацилирования к определяющей скорость стадии деацилирования должен приводить к излому на графиках lnfecat-i-1 /Т, но график in&cat/Km от 1/Г должен оставаться линейным.
Во втором случае
Таблица 56. Термодинамические параметры активации ферментативного гидролиза
Кинети-
ческий
параметр
дН , ккал/моль
е.е.
Литера-
турный
источник
а-Химотрип-
син
Трипсин
Эластаза
Субтилизин
Пепсин
Карбоксипеп-тидаза А
Термолизин
Нейтральная протеиназа Вас 111ие eubttIte
CH„C00C,H.N0_-n о b A d
AcPheOMe
AcTrpOMe
Pa-Im
TosAj-jOMe
CH_ C00C,H.N0_ —n 3 6 4. S
ZGlyONp
BocAlaONp
AcPheOMe
ZPhe(N02)PheApm
ZbeuValPhe(N0„)--AlaApm
ZGlyGlyPhe
ZGlyGlyVal
FaGlyPheAla
FaGlybeuAla
*2
*3
к
*3
V*
k**
ъ *
cat
k , cat * + cat cat
k ./к
cat m
fe +/K
cat n
20.5 15,0
9,7* 16,9 10,1
12.3
7.8
15.0
19.4
5.4 9,77
10,2
8,6
8,53
3,83
.7,8
3.4
12.6
15.1 8,6 1 ,5
3.8 5,7
+13,5 -18,0 -15,9* +11 ,7 -14,8 -10,0
-5,8 -31,4 -17,2 -16,1 -9 98 -7,49
-23,9
-39,3
-44,6
-6,7
О
-22,9
-26
-37,2
-14,5
[2452] [24521 [1987]
[2453] [2453] [24541 [2455] [24551 Г2456] [24571
[2458] [24591
[2459]
[2459]
[2019]
[1907]
[1907]
[2327]
[2327]
[2460] [2460]
[2460]
[2460]
В трис-буфере. "Калориметрические данные.
оба графика могут давать излом, так как при этом к ./К~=к„кГ1/К (к „+2г„), и
cat ш с. о в —с и
в зависимости от соотношения к3 и к_2 значения константы скорости второго порядка будут к?/Кв или кгк3/Квк_г. Этот случай, по-видимому, наблюдается наиболее часто [1907,2452,2461,2462,24641.
Конформационные изменения, приводящие к изменению кинетических параметров ферментативной реакции, зарегистрированы в большом числе случаев (см.: [1661,24491). Различные конформеры имеют, как правило, сильно отличающиеся термодинамические характеристики связывания и превращения субстрата. Например [24521, химотрипсин изменяет свое состояние при гидролизе п-нитрофенил-ацетата, что проявляется в изломе графиков 1п*2-И/Т (при 20,9° С) и 1пХе/&2+1/Г (при 20,1° G). Значения дН* и д5* при низких температурах составляют 20,5 ккал/моль и +13 э.е., а при высоких - 0,34 ккал/моль и -0,55 э.е. Активационные параметры деацилщэования не зависят от температуры. Од-
нако для некоторых п-нитрофениловых эфиров 5-алкилфурил-2-карбоновых кислот зависимость 1п&3 от 1/Т нелинейна, тогда как для других не наблюдается излома на графиках Аррениуса [2462]. По гидролизу AcTrpOEt (при pH 8) переход между двумя формами а-химотрипсина (^ и А±) наблюдается при 25° С [2461]. У пепсина переход между состояниями был обнаружен при 34° С для гидролиза AcPheTyr [2465] и при 12° С для гидролиза ZLeuValPhe (N0?)AlaApm [1907]. Таким образом, температура конформационного перехода может заметно зависеть от структуры субстрата.
Интересно сравнение параметров активации для термоустойчивого термолизина и слизкой ему, но существенно более лабильной нейтральной протеазы Bacillus subtil Is. Последняя имеет значительно большую энтальпию активации (по &cat/Km) и менее отрицательную энтропию, чем терчгпизин, что, по-види-мому, связано с более "рыхлой" структурой нейтральной протеазы [2460].
Наконец, при больших величинах изменения удельной теплоемкости (дС ) дЯо и дSo являются нелинейными функциями температуры [2457,2463,2466], так как
1 аСр
1пК = дЯ - + дS +-----------1пГ.
в о ip ° R
В связи с этим очевидны преимущества к а лошме триче ских измерений тепловых эффектов реакции при постоянной температуре. Такие определения для тепловых эффектов химических стадий очень немногочисленны (см., например: [2455]), и пока их трудно сравнивать с данными по температурной зависимости кинетических параметров. Значительно чаще калориметрические измерения используются для определения энтальпии и энтропии равновесных процессов (ассоциация фермента с субстратом или ингибитором) [2467,2468]. При этом данные, полученные методом калориметрии и методом температурной зависимости констант диссоциации фермент-лигсндных комплексов, также довольно сильно различаются. Это видно из сравнения параметров дЯ_ и дSo, получениях для химотрипсина (табл.57).
