Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Связывание ингибиторов во многих случаях приводит к конформационным перестройкам в белке, что проявляется в изменениях их спектральных и других физико-химических свойств [13753, в изменении рЛ ^ ионогенных групп, сопровождающемся связыванием или отщеплением протона [2575-25771, а также в бблььей устойчивости комплексов ферментов с некоторыми ингибиторами к денатурации по сравнению со свободными белками [2578,25793.
Связывание ингибиторов зависит также от олигомерного состояния фермента [25803.
5.9.3. Специфические обратимые ингибиторы
К зтому типу ингибиторов можно отнести субстраты, продукты ферментативной реакции и их аналоги.
Ингибирование субстратами подробно исследовано на примере карбоксипептидазы А [1738,2581-25833. Кинетическая схема катализа этим ферментом описывается схемой (37), а скорость реакции - уравнением (38) (см. разд.4.1.6).
При низких концентрациях субстрата реакция подчиняется кинетике Михаэли-са-Ментен. При увеличении [S3о с ферментом связывается вторая молекула субстрата, активируя процесс гидролиза ф>1), и, наконец, дальнейшее увеличение концентрации субстрата приводит к связыванию третьей молекулы, которая ингибирует фермент. Значение р для разных субстратов варьирует в пределах от 2 ло 4,5, а величины К'в примерно на порядок выше значений Кд. Ингибирование характеризуется константой К” порядка 17-30 мМ, за исключением ZGlyPhe, для которого iP'=0,3 М [1738J. Интересно отметить, что ацетилирова-ние карбоксипептидазы N-ацетилимидазолом лишает фермент способности ингибироваться субстратом [25843-
Продукты гидролиза, как правило, ингибируют ферменты. Анализ типа инги-б1фования продуктом позволяет сделать важные выводы о механизме ферментативной реакции [25853. Однако на этом пути встречаются довольно большие сложности. Так, было показано [2175,2585,25863, что при гидролизе соединений типа AcPhePheOMe, катализируемом пепсином, ацильный фрагмент (AcPheOH) проявляет свойства неконкурентного ингибитора, тогда как второй продукт (HPheOMe) является конкурентным ингибитором (при pH 2). Отсюда был сделан вывод об упорядоченном отщеплении продуктов из комплекса с ферментом 16*
Е + S ES
EPQ
ЕР
Е + Р
+
Q
(где P=HPheOMe и Q=AcPheOH) и о существовании промежуточного аминофермента, которому приписывалась ковалентная природа. При рН<»4 наблюдается конкурентное ингибирование ацетилфенилаланином, что указывало на неупорядоченный механизм при повышении pH:
Противоположные результаты были получены [2587 3 по ингибированию ацетилфенилаланином катализируемого пепсином гидролиза AcPheTyr в области pH 2*4,5. На основании полученных данных постулировался упорядоченный механизм при низких pH и переход к неупорядоченному по мере ионизации группы с
Наконец, было показано [25883, что ргзличия в типе ингибирования могут возникать, если ингибитор связывается не только со свободным ферментом, но и с фермент-субстратным комплексом. Таким образом, по крайней мере, в случае пепсина, результаты ингибирования продуктом не позволяют ответить на вопрос об упорядоченности механизма гидролиза.
Весьма эффективные ингибиторы получаются, если объединить в одной структуре оба продукта ферментативного щцролиза (так называемые bi-product analogues). Например, I-бензилсукцинат (I) ингибирует карбоксипептидазу с К(=0,45 MKM [25893, частично воспроизводя структуру гиппуровой кислоты и фенилаланина:
EPQ
!
EQ
Е + Q
Рка«з
I
Соединения (II) и (III) оказались чрезвычайно эффективными ингибиторами карбоксипептидаз В и N соответственно [2590,25913:
Сходного типа ингибиторы были предложены [2592 3 для ряда сериновых про-теаэ группы трипсина (плазмин, калликреин, тромбин и др.), а также для некоторых металлсодержащих протеаз [2593,25943.
Очень большое число работ посвящено исследованию ингибирующего действия аналогов субстратов. Сравнение констант ингибирования химотрипсина амидами и эфирами ацетил-С-аминокислот показало очень небольшие отличия в амидов
и эфиров, тогда как iT соответствующих субстратов различаются весьма значи-
тельно, причем Kt и /Г амидов весьма близки [16663. В случае эфиров мевду К. и К' наблюдается заметное отличие. Отсюда следует, что К’ амидов совпа-
I Ш Ш
дает с Кд - константой диссоциации комплекса Михаэлиса. В случае же эфиров iT - эффективная константа. Равенство и Кд имеет место и при пепсиновом катализе [2338,2444,25953. В случае пепсина лишь нейтральных ингибиторов не зависит от pH [23383, однако, например, в термолизине такой зависимости нет и для заряженных субстратов [25963.
В большинстве случаев ингибирующая способность аналогов субстратов протеаз определяется не только первичной, но в значительной мере и вторичной
специфичностью, т.е. структурой групп, удаленных от расщепляемой в соответствующем субстрате связи [2597-2602 3. В этом отношении интересным примером является ингибирование катепсина D и пепсина пептидами, содержащими обычно расщепляемую этими ферментами связь PhePhe (табл.61).
