Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Химотрипсин 1,2 1 ,3 923 0,32 0,47 680
Трипсиноген 0,0036 3,4 1 ,05 0,004 6,3 0,63
Трипсин 1,2 1,45 л827 0,47 5,8 81
*п-Нитрофениловые эфиры.
Как видно, различие в активности составляет 3-4 порядка, причем главным образом за счет снижения каталитической констант'. Былс показано [2062 3, что увеличение ионной силы раствора приводит к увеличению активности трип-синогена за счет уменьшения величины К .
m
Были также обнаружены активнее формы пепсиногена, образующиеся в процессе его активации при смещеьии pH из нейтральной в кислую область [2064, 2065].
Как отмечалось ранее, активация зимогенов часто происходит неоднозначно, причем образуются разные формы ферментов, отличат «даесч структурой N-конце-вой части молекулы или числом и структурой полилептидных цепей. Было отме чено, что разные формы активных протеаз могут отличаться по своим кинети-
ческим характеристикам [292,2066]. Формы химотрипсина с различным образом расщепленной С-цепью (6-химотрипсин, а^химотрипсин) отличаются от а-химо-трипсина величиной по отношению к сложноэфирным субстратам в щелочной области [2066]. Было показано также [12071, что формы а-, (3- и 7-трипсина заметно различаются по кинетическим параме1 ’рам в отношении одного и того же субстрата.
Аналогичная картина наблюдается для тромбина. Активация протромбина фактором Va (в присутствии Са2+ и фосфолипида) приводит к а-тромбину, который может подвергаться автолизу с образованием (3- и 7-тромбинов. Кроме того, могут образовываться другие формы - е, (Зт и др. Все они определенным образом отличаются по своим каталитическим свойствам [2067]. Было показано [2068], что (3-цепъ а-тромбина, будучи выделена в особых условиях, сохраняет до 5% каталитической активности.
Весьма сложным является процесс активации ренина. Проренин - неактивный белок с Мг«43 кДа быстро активируется с расщеплением связи Arg63-Ser64, образуя одноцепочечный активный фермент. Последний способен медленно превращаться в двухцепочечную форму с Мг«36,5 кДа путем выщепления остатков 355-356 [20691.
Двухцепочечный фермент энтеропвптидаза при восстановлении дисульфидной связи образует каталитически активную легкую цепь, обладающую трипсиноподобной специфичностью по активации трипсиногена. Однако активация в этом случае идет много медленнее и только при высоких значениях pH. Интересно, что соевый трипсиновый ингибитор, не способный подавлять нативную энтеропептидазу, эффективно реагирует с легкой цепью [20701. Отмечалось та^же протеолитическое расщепление энкефалиназы [20711, ка-шШпНов [2072] и плаз-мина (образование "микроплазмина" [2073,20741), мало влияющее на свойства ферментов.
Интересным примером является действие субтилизина на термолизин [20751-При этом отщепляется N-концевой тетрапептид и происходит расщепление по связи Thr224-Gln225. Образовавшиеся две цепи с 24 и 10 кДа очень прочно ассоциированы. Такой термолизин S (по аналогии с РНКзой S) сохранает 3% активности нативного фермента.
4.6.2. Химическая модификация
Существует очень большое число работ по химической модификации ферментов, в том числе и амидгидролаз (см. обзоры: [163,2076-20801).
Химическая модификация амидгидролаз обычно приводит к падению их каталитической активности за счет увеличения 2Г или уменьшения *cat. Однако некоторые модификации не приводят к снижению связывающих субстрат свойств фермента. Так, метилирование каталитически важного остатка HIs5i’ в химотрипси-не [1324] не влияет на способность связывать субстраты и ингибиторы [1325, 1326,2081,20821. Каталитическая активность (Kis57)-метилхимотрипсина, хотя и уменьшается примерно на пять порядков, все же сохраняется [13251. Связывание субстратов сохраняется и в ангидрохимотрипсине. В некоторых цистеино-вых протеазах удается заменить тиоловую группу в остатке цистеина активного центра на гидроксильную группу и в сершовых - гидроксил серина на тиоловую группу, получая искусственные ферменты [20831- Оказалось, что тиол-
субтилизин гидролизует n-нитрофениловые эфиры с более высоким значением чем субтилизин [20843- Удалось получить также селенолсуб-
тилизин [20853. Этот искусственный фермент более, чем на четыре порядка активнее в отношении ацилтрансферазных реакций, чем субтилизин.
Нередко химическая модификация изменяет соотношение между пептидазной и эстеразной активностью ферментов. Так, азосочетание а-химотрипсина с диазоаналогом субстрата
происходящее по остатку Туг146, приводит к значительному увеличению амидаз-ной активности (по SucGly3PhepNA) по сравнению с эстеразной (по AcTyrOEt)
- соотношение констант скорости второго порядка для эфира и амида меняется с 300 у ^модифицированного фермента до 50 - у модифицированного [2086].
Противоположные изменения наблюдаются [20873 при азосочетании (с диазо-1Н-тетразолом) и нитровании (тетранитрометаном) карбоксипептидазы А. Диазосочетание проходит по остатку Туг248 и приводит к увеличению эстеразной и к небольшому падению амидазной активности, а последующее нитрование остатка Туг198 не влияет на эстеразную активность, но существенно снижает амидаз-ную.
