Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Отмечалось также увеличение амидазной активности карбоксипептидазы А и термолизина [2088] при химической модификации, однако специфическая модификация Туг248 в карбоксипептидазе А приводит к полной потере амидазной при сохранении эстеразной активности [1260].
Изменение специфичности трипсина наблюдалось [2090] при этилировании фермента триэтилоксонийфторборатом. Полученное производное теряло способность гидролизовать катионные субстраты и связывать специфические ингибиторы, но сохраняло и даже увеличивало способность связывать и гидролизовать нейтральные субстраты. Гидрофобизация химотрипсина увеличивает значение в 2,3 раза [2091].
Модификация может быть направлена на изменение устойчивости и растворимости фермента в органических растворителях. Так, модификация поверхностных аминогрупп химотрипсина и трипсина поликарбоновыми кислотами значительно увеличивает их стабильность к тепловой денатурации [2092], а введение в молекулу химотрипсина эфиров полиэтиленгликоля позволяет получить препараты, растворимые в трихлорэтане [2079].
В случае металлсодержащих амидгидролаз значительный интерес представляют изменения кинетических параметров в зависимости от характера металла, присутствующего в активном центре. Ион Zn2+ в карбоксипептидазе А может быть заменен на ион Со2+ [2093]. При этом наблюдается значительная активация фермента: значение к ./К для гидролиза ZGlyGlyPhe возрастает с 4.105
__4 _4 р, сат} ш _ _-j _*
М с для Zn -фермента до 9,4-10 М с (за счет * t) [1738]. Аналогичная активация наблюдалась для аминопептидазы из Bacillus subttlls [2094] и Aeromonas sp. [2095].
Обычно углеводы, входящие в состав амидгидролаз, не оказывают какого-ли-
C,Hc.C0NHCHC00CH„
О D
бо эффекта на их специфичность или каталитические свойства. Однако имеются исключения из этого правила. Так, различные дрожжевые карбоксипептидазы Y, отличающиеся по углеводному составу, имеют разные кинетические характеристики [20963.
Было отмечено [1917,2097-20991, что гликозилирование многих белков происходит в местах (3-изгибов полипептидной цепи. Именно эти участки являются наиболее уязвимыми в реакциях ограниченного протеолиза. Вероятно, поэтому гликозилирование защищает белки от неспецифического расщепления протеазами. Это представление получило некоторое экспериментальное подтверждение [21003.
Следует также отметить различия в специфичности, наблюдающиеся у разных форм субъединичных амидгидролаз. Аминопептидаза из Bacillus stearotfwrmo-philus API состоит из двенадцати субъединиц аир, входящих в различные формы фермента в разном соотношении. Гидролиз пептидов, содержащих остатки Asp и Glu, происходит лишь полными формами фермента, тогда как изолированные а- и (3-субъединицы гидролизуют нейтральнее пептиды [юн].
4.6.3. Направленный мутагенез
Известен ряд примеров различной аг гивности природа ix мутантных форм некоторых амидгидролаз [1195,2101-2103]. В случае точечных мутаций появляется возможность сравнивать свойства ферментов, в которых произошла замена одной аминокислоты на другую. Однако эти возможности были весьма ограниченны, пока не была разработана техника направленного мутагенеза (см. обзоры: [2104, 2105]). С тех пор работы по направленному мутагенезу ферментов стали нарастать лавинообразно (см.: [2106-211 о]). Это направление получило название белковой инженерии ферментов и успешно используется для выявления связи их структуры и функции.
Наиболее широко этот метод был использован для исследования субтилизина с целью получения фермента, устойчивого к окислению [2111] и к тепловой денатурации [2112-2115], для изменения pH-оптимума фермента [2116], выяснения роли отдельных остатков в области активного центра в специфичности фермента [2117-2121З и, наконец, для подтверждения механизма стабилизации переходного СОСТОЯНИЯ [2122].
Окисление Met222 приводит к значительному снижению активности субтилизина. Была произведена замена этого остатка на 19 других аминокислот. Оказалось, что замена на нейтральные аминокислоты лишь немного сказывается на активности, тогда как введение заряженных остатков снижает активность в 200-300 раз. Ферменты, содержащие вместо Met222 остатки других нейтральных аминокислот, устойчив! к о: ;ислечию. Были предприняты попытки увеличить термостабильность субтилизина введением одаой или двух дисульфидных связей в по-гожечия 22-87 или 24-87; как оказалось, это не приводит к увеличению тер-мо- и ав 'олитической стабильности [2112]. Образовавшаяся S-S-связь лежит на поверхности и имеет необычную напряженную кглформацию [2113]. Обширные исследования различных типов S-S-содержащих субтилизинов не выявили связи между наличием и положением дисульфидных мостиков и устойчивостью фермента [2115].
Замены в субтилизине BPN’ остатков Asp99 на Se1- или Glu156 на Ser и др.
приводят к сдвигу рКа His64 от +0,08 до -1,0 единицы [21163. Замена Asn155
- Leu, не влияя на Кт, снижает активность более, чем в 200 раз. Авторы [21223 рассматривают этот факт, как подтверждение гипотезы стабилизации ферментом переходного состояния субстрата (см. гл.7 и 8).
