Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Весьма подробно была исследорана роль остатков в связывающей субстрат полости субтилизинов BPN' и Bacillus lichenlformis в проявлении ими субстратной специфичности. Были произведены замены остатков в положениях 166, 156, 169 и 217. Остаток G.1 у166 заменялся на остатки различной гидрофобности, в результате чего были получены мутантные субтилизины с измененной специфичностью. Так, введение в положение 166 остатка Не увеличивает более, чем на порядок, значение Scat/Km для субстратов, содержащих Ala в положении Р , и снижает почти на три порядка это значение для субстратов с Phe и Туг [21093- Замена сразу трех остатков Glu156, Gly169 и Туг217 в субтилизине BPN' на остатки, свойственные ферменту из Bacillus \lchenffnrmis (Ser156, А1а169 и Leu217), дает мутант со сппцифичностью, близкой последнему ферменту [21203. Наконец, замена в области связывания иона Са2+ Рго172 и Gly131 на остатки Asp увеличивает связывание этого иона в 6 раз [21213.
Довольно обширные замены были проведены в трипсине крыс [2119,2123-21263. Так, замена остатков Gly21b и Giy226 на Ala приводит к изменению предпочтительности фермента по отношению к Arg- и Lys-содержащим субстратам [2123,2124]. Снижение при этом каталитической активности, по-видимому, обусловлено деформацией оксианионнг* полости фермента [2124]. Была также произведена замена субстратсвязывающего остатка Asp189 на остаток Lys. Фермент при этом теряет способность связывать и превращать субстраты с Lys или Arg в Р , но приобретает слабую химотрипсиновую активность. Боковая цепь остатка Lys189 в мутан1но™ ферменте, по-видимому, направлена вне связывающей субстрат ПОЛОСТИ [21261.
Мутация зимогена аспартатной протеиназы прохимозина [2127] в области участка процессинга (27-31) позволила установить, что этот фермент и, по-видимому, другие аспартатные протеиназы могут образовываться путем расщепления сразу по связи Phe42-Gly, а не обязательно через стадию отщепления пептида 1-27 (см. гл.5). Для другой аспартатной протеиназы - ренина замена А1а317 на Asp привела к .сдвигу рН-иптимуиа на 0,5 единицы в кислую область [21281, что частично подтверждает роль этого остатка в проявлении ренином, в отличие от других аспартатных протеиназ, нейтрального рЧ-оптимума.
Имеются данные о направленном мутагенезе нейтральной эндопептидазы (3.4.24.11) [2129], вирусных протеиназ [2130,2131J и р-лактамаз [2132-21341. Так, Заменой SerTO в (3-лактамазе (RTEM) на Cys была получена тиол-(3-лактамаза, сохранившая частично активность по гидролизу бензилпенициллина и чувствительная к п-хлормеркурийбензоату - типичному ингибитору цистеиновых амидгидролаз.
Наконец, следует упомянуть весьма неожиданный результат замены остатка Туг248 в карбоксипептидазе А на остаток фенилаланина ЙН35]. Такая мутация не изменила k . . и лишь несколько увеличила значение К . Поскольку феноль-
cat m
ному гидроксилу остатка Туг248 весьма основательно приписывалась роль общего кислотного катализатора в катализе этим ферментом (см. гл.7), такой результат заставляет пересмотреть сложившееся мнение.
4.7. Синтетическая активность амидгидролаз
Поскольку при нейтральных значениях pH константа равновесия реакции *р
RCONHR1 + Н20 -----* RCOCT + +H3NR1
близка к единице (см. разд.3.1), при достаточных концентрациях реагентов протеолитические ферменты могут катализировать синтез амидной связи. Впервые такая возможность была продемонстрирована в 1937 г. [21363. В последующие годы интерес к препаративному ферментному синтезу пептидов значительно возрос в связи с возможностями препаративного получения некоторых ценных пептидов и белков (см. обзор: [21373).
В качестве катализаторов используются а-химотрипсин [2138-21413, фицин [21423, термолизин [2141 ,2143-21453, карбоксипептидаза Y [2146,21473, микробные металлопротеиназы [5883 и другие ферменты. Довольно хорошие результаты дает использование иммобилизованных ферментов [2148,21493, а также применение модифицированных ферментов, обладающих пониженной амидазной активностью, но сохраняющих эстеразную. К последним относятся тиолсубтилизин [21503 и NE-Memn(His57)-химотрипсин [21513.
Специфичность ферментов в реакциях синтеза хорошо согласуется с их специфичностью в гидролитических реакциях [2139,21523. То же самое относится к pH-зависимости пептидного синтеза [21513. При использовании в качестве катализатора сериновых протеаз, они с эфиром быстро образуют ацилфермент и затем ацильная груша переносится на амин:
RCOOEt + Е-ОН---------> RC00-E,
RC00-E + H2m1 --------- RCONHR1 + HQ-E.
Была подробно исследована кинетика реакции синтеза в таких условиях и предложены способы определения максимального выхода [2140,2143,2152,21533.
Основной вклад в изменение стандартной свободной энергии обратимой реакции синтеза-гидролиза амидной связи вносит ионизация продуктов гидролиза. Поэтому выгодно проводить синтез в условиях, когда оба реагента не ионизированы. Однако в обычных условиях этого достичь нельзя. Были предложены остроумные методы обхода этой трудности. Так, реакцию синтеза можно проводить, используя эфир ациламинокислоты и аминокомпоненту при рК«10, когда последняя не ионизирована.
