Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Чем же обусловлено значительное различие в скоростях гидролиза амидов и сложных эфиров при катализе сериновыми протеазами? Оказалось [2008-2010], что скорость ферментативного гидролиза различных производных одной и той же ациламинокислоты линейно связана с величиной изменения стандартной свободной энергии реакции (рис.62). Такая зависимость является проявлением известного постулата Хэммонда (см. разд. 3.4.3), в соответствии с которым,
РИС.61. Зависимость константы скорости 2-го порядка от р&а уходящей группы при гидролизе
а-химотрипсином субстратов типа АсТугХ [2001]
Заместитель (X): 0С2Н5 (1), NHCgH^NOg—п (2),
NHC6H4N02-jH (3), ШС6НДС1-И« (4),
ШСбН4С1-п (5), ЫНСбН40СН3-Л (б),
NHCgHjOCHg—тг (7), NHCgH^Cf^-n (в),
HHCH(CH3)C0NH2 (9), NHOH (10),
NHCH^CONHj, (11), HHNHg (*2)» NHg
NHCH3 (14)
l9
6
H
2.
0
-Z
-*-z
*«*/*m •I
J 4 S 7 10,
6 e
_l___________________I_________________I________________I________________I_________________L_
e в io рк
РИС.62. Зависимость изменения стандартной свободной енергии гидролиза и константы скорости 2-го порядка катализируемого химотрипсином гидролиза [2009]
Субстраты типа AcPhe(N02~n)-X
Заместитель (X): 0С2Н5 (;), 0СН3 (2),
NHC6H4N02-n (з), NHC6H5 (4), NH2 (5),
NHNHg (б), NHCH2CONH2 {7}, NHCH(CH3)C0NH2 (в)
О 1 г 3 Н 5 Б RT 1,1 (kCai lKL Ь мал/моль
чем выше энергия исходного состояния в мономолекулярной реакции, тем ближе структура переходного состояния к этому исходному состоянию. Другими словами, при прочих равных условиях химотрипсиновый катализ идет тем эффективнее, чем менее стабилизированной является расщепляемая связь. Различие в скоростях гидролиза эфиров и амидов обусловлено исключительно структурой расщепляемой связи, а не особенностями фермент-субстратного взьлмодействия.
Указанная корреляция справедлива для "подуспецифических" субстратов, т.е. таких, уходящая группа которых заметно не взаимодействует с ферментом.
Эта корреляция может быть описана эмпирическим уравнением:
cat
-aG = 0,931 fiTln----- +1,616 (г=0,999). (54)
о к,
m
Однако, специфические субстраты, например 1}-ацетил-п-нитрофенилаланил-Х-аланиламид, выпадают из нее, поскольку остаток аланина эффективно взаимодействует с активным центром фермента [2011].
Для других ферментов имеется слишком мало данных по скоростям гидролиза в сериях различных производных ациламинокислот. Линейная зависимость скорости и свободной энергии, по-видимому, выполняется для карбоксипептидазы А [2012], тогда как для пепсина различия в скоростях гидролиза амидных и слокноэфирных (депсипептидных) субстратов очень невелики [2013].
I- ZTrpOCgH^NOg—п; г- ZTrpOCgH^COMe—п;
3 - ZTrpOCgH^Cl-n; 4- ZTrpOCgH^OMe-n;
5- AcTyrOMe; б- АсТгрОМе; 7- AcTrpOEt;
8,9- AcPheOMe; 10- BzTyrNHCgH4N0g-n;
II- BzTyrNHCgH^NOg-^; 12- BzTyrNHCgH^NOg-o; 13- AcTyrtfflCgH^NOg—n; 14- AcTyrNHCgH^NOg-^; 15- AcTyrNHCgH^Cl-^; 16- AcTyrNHCgH^Cl-n; 17- AcTyrNHCgH^OMe-^; 18- АсТугШСбНдСН3-тг; 19- AcTyrNHCgH^OMe-p; 20- AcTyrGlyNHg;
21- AoPheGlyNHg; 22- AcPheNHg;
23- AcTyrNH2; 24- AcTyrNHCH3
Рис.63. Зависимость lg(ftoat/K ) от pKg уходящей группы в реакциях химотрип-сина со специфическими субстратами [1405]
Изучение влияния структуры уходящей группы на химотрипсиновый катализ ([1405, с.388]) привело к выводу о том, что изменения рЯа этой группы сопровождаются изменением механизма реакции и стадии, определяющей скорость. Поэтому в широком интервале рйа зависимость константы скорости от основности уходящей группы имеет сложный криволинейный характер (рис.63).
Вторичная специфичность и структура субстратов. Имеется очень немного публикаций, в которых количественно прослеживается связь структуры удаленных от расщепляемой группы остатков и скорости ферментативного катализа. На качественном уровне исследована зависимость скорости расщепления В-цепи инсулина, а также трипсиногена карбоксильной протеазой из Aspergillus saltol [880].
Интересные данные были получены [2014] в отношении вторичной специфичности гидролиза химотрипсином эфиров и амидов трипептидов. Оказалось, что уменьшение гидрофобности остатка в-положении Р2 увеличивает скорость гидролиза эфиров и уменьшает скорость гидролиза амидов (рис.64).
mvjvt)
РИС.64. Зависимость относительных скоростей катализируемого химитрипсином гидролиза эфиров (У1 ) и амидов (V"2) от гидрофобности боковой цепи в положении Р2 для соединений типа RTyrOEt и RTyrNHg [2014]
Заместитель (R): Ас (;), GlyGLy (г),
GlyAla (3), GlyVal (4), GlyLeu (5),
GlyNle (6)
Было также исследовано влияние вторичной специфичности ацилдипептидов на связывание их химотрипсином и на положение равновесия в реакции ацилирова-ния этими дипептидами фермента [2015]. Оказалось, что для серии соединений общей формулы АсХ-ТгрОН, где X = Gly, Ala, Val, Leu и Phe, связывание химотрипсином (-aGq) линейно увеличивается при увеличении значения % для остатка X, тогда как положение равновесия реакции ацилирования не зависит от гидрофобности этого остатка.
