Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
янном и максимальном значении й и постоянной концегтрация субстрата
выгодно иметь высокие значения /Г (так, чтобы /Г >[S]о) [1613, с.304], и в этом случае наибольшая скорость будет достигаться унеличенче.л k
caV
Однако
эта величина, по-видимому, не может увеличиваться сверх определенного предела, зависящего как от структуры расщепляемой связи, так и от типа каталитического аппарата фермента. Поэтому дальнейшая максимизациг скорости будет достигаться уменьшением /Г, т.е. улучшением связывания субстрата. Более детально следствия наблюдаемых соотношений fecai и /Г, будут разобраны в гл.8.
Следует отметить, что сходные солтнсленин кинетических констант наблюдаются не только для гидролкгичес:;их, но и для других типов ферментов [2041, С.72].
Соотношение "лучшее связывание - лучший катализ" выполняется для некоторых протеаз в серии субстратов, различающихся Реостатном. Так, для1 эфиров ациламинокислот была предложена [2042] линейная зависимость, связывающая величины &2 и Кд в гидролизе химотрипсином: фа
lgft2 = С + раох + ~ рке,
*ъ
где С - константа, Ра и °х _ параметры уравнения Гаммета, а фа и фь - величины чувствительности субстрата к изменению гидрофобности (тс) на стадии ацилирования и связывания.
4.4. Эффективность
Если специфичность фермента выявляется при сравнении скоростей превращения в серии субстратов, то, чтобы оценить его эффективность, необходимо сраЕ нить скорость превращения субстрата, катализируемого ферментом, со скоростью в модельной, неферментативной реакции. Здесь возникает несколько проблем.
Во-первых, это проблема выбора модельной реашгяи. Косовер [2043] ввел представление о конгруэнтной модельной реакции, т.е. такой неферментативной реакции, которая идет через те же самые или очень сходные промежуточные со-
единения, ито и ферментативная реакция. Таким образом, выбор конгруэнтной модели подразумевает знание механизма как ферментативной, так и модельной реакции. !На современном уровне наших знаний это не всегда можно сделать однозначно. Для гидролитических реакций, катализируемых четырьмя известными группами амидгидролаз, наиболее близкими конгруэнтными моделями, очевидно,' являются реакции, ка’-ализг'руемые низкомолекулярными веществами, природа которых сходна с природой каталитически активных групп фермента, т.е. ионами R-S- и R-СГ, карсоксилат-ионом и ионом металла. Однако и здесь возникают проблемы, связанные, например, с концентрацией каталитически активной формы нуклеофила в фзрменге.
Во-вторых, это проблема выбора сравниваемого кинетического параметра. Модельные и ферментативные реакции различаются молекулярностью. Первые -обычно реакции второго порядка, тогда как скорость ферментативного процесса зависит только от концентрации фермент?-субстратного комплекса. Очевидно, что сразнивать лучше везго константы одинакового порядка, нацример константу скорости второго порядка модельной реакции №он, йБН и т.д.) и константу скорости второго порядка №cat/Km) ферментативной реакции. В то же время представляет гаторес сравнение величины константы скорости второго порядкг для модельной реакции и й фермента. Такое сравнение дает величину эффективной концентрации субстрата, при которой скорость его превращения в продукт Iавна скорости ферментативной реакции.
Следует помнить, что величина *оа1/йт> &cat и Кт могут быть эффективными BejiH4HHa.*i, не характеризующими скорость или равновесие на какой-л^бо стадии лроцесса, а являющиеся комбык цией констанг± с^ороотей отдельных стадий (см. разд.4.1.3). Кроме того, и константа скорости модельной реакции может быть эффективной величиной, если существует равновесие нескольких различающихся по реакционной способности форм субстрата. Эта проблема будет подробнее рассмотрена в гл.8.
Наконец, трудным вопросом при определении эффективности ферментативного катализа является выбор субстрата. Скорость модельных реакций мало зависит от структура субстрата (для одинаковых расщепляемых связей), тогда как скорость ферментативной реакции м< жет меняться на 5-7 порядков при изменении структуры даже удаленных от расщепляемой группы участков молекулы.
Что касается протеолитических ферментов, поскольку их природными субстратами являются часто йвл1;и, то для определения эффективности следовало бы выбирать именно эти субстраты. Однако очень трудно определить скорость гидролиза одно*! амидной связи в таком биопо^ .шере не только в неферментативной, но л в ферментативной рзшкции. В табл.42 приведено несколько примеров таких реакций.
Во многих случаях скорости гидролиза белков не очень велики.
г*ис.68. Зависигисть ни-мализованных констант окорсм ти деацилирования ацилхимотрипсинов от величл“ сродства к ферменту соответствующих амидов и-ацетил-С-ашшокчслот [3405]
-lg К?(Л)
Обширный экспериментальный материал имеется по гидролизу синтетических пептидов. Определение эффективности на основе этих данных наиболее правильно при "насыщении специфичности", т.е. при использовании субстратов, максимально быстро превращающихся данным ферментом. Следует учитывать, что в каждом ряду субстратов может быть свой уровень "насыщения". Например, скорости деацилирования ацилхимотрипсинов стремятся к пределу в ряду ацильных остатков с увеличивающейся гидрофобностью боковой цепи, достигая максимального значения в случае N-ацзтилтриптофанилхимотрипсина (рис.68).
