Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Другой способ подавить ионизацию реагентов - это проводить реакцию синтеза в водно-органическом растворителе. При этом можно добиться очень значительного изменения константы равновесия [1424,2145,2154-21583. Этим способом удается синтезировать не только пептиды, но и эфиры ациламинокислот [14243, равновесие для которых в водной среде сильно сдвинуто в сторону гидролиза. Следует отметить, что субтилизин сохраняет свою каталитическую активность в безводном диметилформамиде. Реакция в этом растворителе между эфирами карбоновых и ациламинокислот и углеводами позволила получить ацил-моносахариды с высокими выходами [21593. Удачным для сегментного синтеза пептидов, оказывается замена части воды, добавляемой в органический растворитель, этиленгликолем, формамидом и пр. [21603.
Методы пептидного синтеза с помощью протеаз были с успехом использованы для получения биологически важных пептидов - энкефалинов [21611, ангиотензина II [21621, секретина [21631, а также для модификации белков - соевого трипсинового ингибитора [21641 и рибонуклеазы А [21651.
Особенно впечатляющим является получение инсулина человека из свиного инсулина с помощью протеазы I из Achromobacter [588,21661. Этот фермент селективно отщепляет остаток А1а30 в В-цепи инсулина. Обработка такого дез-(А1а30)-инсулина избытком mpem-бутилового эфира треонина в присутствии того же фермента и органического растворителя привела после удаления трет-бу-тильной группы к инсулину человека с выходом 85%.
4.8. Побочные и необычные реакции, катализируеыые аыидгидролазаыи
Многие амидгидролазы катализируют не только реакции гидролиза и синтеза амидной связи, но и другие реакции, из которых наиболее интересной является реакция транспептидации.
4.8.1. Транспептидация
Известны два типа таких реакций транспептидация по типу ацильного переноса [21671
Е
RCONHR1 + R2NH2 ------* RCONHR2 + R1NH2 (55)
и транспептидация по типу аминопереноса [21681 Е
RCONHR1 + R2C00H ^------ R2CQNHR1 + RC00H. (56)
В этих реакциях исходный амид обычно называют донором транспептидации, а соединение, на которое происходит перенос фрагмента донора, - акцептором транспептидации. Акцептором может служить один из продуктов гидролиза субстрата (донора), например [21691:
2LeuTyrNH2------> LeuLeuTyrNH2 + TyrNH2.
Реакция ацильной транспептидации катализируется многими сериновыми и цистеиновыми протеазами [2170-21721. Имеется единственное сообщение [21731
о том, что а-химотрипсин способен катализировать также реакцию аминопереноса
2ZPheLeu------* ZPheLeuLeu + ZPhe.
Аспартатные протеазы катализируют в основном реакции аминопереноса [2174-21761, однако, если донором служит соединение со свободной аминогруппой, то наблюдается также и ацильная транспептидация [2169,2177,21781. Ами-ноперенос, катализируемый пепсином, идет преимущественно с донорами, содержащими свободную карбоксильную группу у переносимого остатка. Долгое время считалось [21761, что пепсин вообще не способен катализировать перенос за-
щищенного по карбоксильной группе остатка, но в дальнейшем выяснилось [16671, что низкие выходы в этой реакции по сравнению с переносом свободной аминокислоты обусловлены меньшим отношением скоростей транспептидации и гидролиза в последнем случае (табл.52).
Таблица 52. Кинетические параметры реакции транспептидации,
катализируемой пепсином (pH 4,6; 37°С); акцептор ZPhe(N0^)ОН [1667]
Донор k -ю2, Ц, MM* &5(1 .3) *5
&5(2.4) *cat
1. AoPheTyr 3,1 0,156 1 ,06 0,019
2. AoTyrTyr 2,93 0,424 0,046
3. AoPhePheApm* * 4,65 1,7 0,95 7,6-10~3
4- GlyGlyPhePheApm 4,89 0,17 8,6-104
*?^=№_4+fe5)fe3/*2*4 (см. схему 13). I.
**Apm - 3-(морфолино)ггропиламид.
.. _i__ .. j____ .
Металлсодержащие эндопептидазы типа термолизина катализируют как амино-, так и ацильную транспептидацию [2173], а аминопептидаза (лейцинаминопепти-даза) - ацильный перенос [2179].
Для карбоксипептидаз до сих пор не обнаружена способность катализировать реакции транспептидации. Исключение составляют D-аланинкарбоксипептидазы [256,2180,21811, катализирующие реакции типа
R-D-Ala-D-Ala + H2NR’--------> R-D-AlaNHR’ + D-Ala.
Важнейшее феноменологическое отличие транспептидации от реакции синтеза пептида заключается в том, что транспептидация всегда идет только в присутствии субстрата, тогда как ресинтез пептида может происходить при наличии в системе только продуктов гидролиза пептида и катализатора.
Выходы продуктов транспептидации существенно вше равновесных выходов продуктов синтеза,- если реакции проводить при низких концентрациях реагентов. Действительно, выход продукта синтеза определяется константой равновесия в реакции -
йр [RC00H1[R NHg1
