Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
системы и метанола можно рекомендовать смесь многоядерных аромати-
28 Глава 2
ческих углеводородов, для силикагеля и дихлорметана - моно-замещенные
производные бензола.
Наличие несимметричных пиков особенно неудерживаемых или слабо
удерживаемых соединений (k<2) характерно для плохо заполненной колонки
(если наличие каких-либо дефектов оборудования исключено). Если одно и то
же соединение дает двойные пики, то чаще всего это обусловлено тем, что
вверху колонки имеется полость. Иногда, чтобы исправить положение,
достаточно добавить в колонку дополнительное количество упаковочного
материала. Асимметрия пиков удерживаемых соединений при симметричном пике
инертного соединения обусловлена нелинейностью изотермы адсорбции и (или)
перегрузкой колонки. В таких случаях получить симметричные пики часто
удается путем уменьшения объема (массы) пробы,
Асимметричность пика определяют, проводя перпендикуляр из точки
максимума к нулевой линии и рассчитывая соотношение расстояний от этого
перпендикуляра до сторон пика на расстоянии 10% его высоты от основания.
Если коэффициент асимметричности As превышает 1,5, то качество заполнения
колонки рассматривается как неудовлетворительное.
Эффективный диаметр частиц внутри колонки не всегда соответствует
тому, что указывает изготовитель. Кроме того, "старение" колонки приводит
к гораздо большему перепаду давления, чем можно было бы ожидать, исходя
из указанного диаметра частиц.
Корреляцию между диаметром частиц, длиной колонки, объемной скоростью,
перепадом давления и проницаемостью колонки устанавливает следующее
уравнение:
где dp имеет размерность мкм, F - мл/мин, I - см, ri - сПз, т-мм, АР -
бар, 23 - численный коэффициент, предназначенный для перевода в СИ.
Линейную скорость определяют по выходу инертного соединения. В табл.
2.2 приведены некоторые данные, позволяющие выбрать подходящие инертные
соединения для различных видов хроматографии. Проблема определения
мертвого времени для обращенно-фазовой хроматографии подробно обсуждена в
разд. 2.2.4.2. Среднюю линейную скорость рассчитывают, исходя из tM и
длины колонки.
Расчет теоретически возможной высоты, эквивалентной теоретической
тарелке, проводят на основании эффективного размера частиц (вычисленного
из уравнения (4)):
dp = 23yFr\l/r2AP
(4)
h=2dp-\-6/u + (dp2/20) и
(5)
Величина h служит мерой эффективности колонки.
Хроматографическая колонка 29'
Таблица 2.2. Инертные соединения, используемые в хроматографии
на силикагеле и на обращенных фазах
Неподвиж Силикагель Обращенная фаза
ная фаза
Элюент
Н-С7Н16 СН2С12 Н20 СНзОН CH3CN
СН2С12
н-С6Н14 CD2C12 d2o CD30H CD3CN
CD2C12
(Ра) (Р) (Р) (Р) (Р)
(Р)
снсь
СНС1з
(Р)
(Р)
Инертное С2С14 С2С14 CH3N02 CH3N02
С2СЦ
вещество (УФ, Р) (УФ, Р) ((УФ, Р) (УФ, Р)
(УФ, р)
(метод об-
ссц
ССЦ
(УФ, Р)
(УФ, Р)
с6н6
С6Н6
(УФ, Р)
(УФ, Р)
d2o/ch3oh d2o/ch3cn
(Р) (Р)
Смеси с элюентом
а Р --- рефрактометрическое обнаружение, УФ --- спектрофотометрическое
в УФ-дна-
пазоне.
Уравнение (5), которое представляет собой упрощенную форму уравнения
(1), позволяет определить h в мкм, a dp и и - в мкм и мм/с
соответственно. С помощью уравнения (1) нельзя вычислить значения
индивидуальных параметров в уравнении Ван-Деемтера. При линейной скорости
около 1 мм/с (Mmin для частиц диаметром 5-10 мкм) оптимальное значение h
соответствует примерно 3dp. Если h превышает это значение вдвое, качество
заполнения колонки можно считать приемлемым только при условии
симметричности пиков. Сказанное выше справедливо только при условии, что
разделяемые соединения имеют низкую молекулярную массу, а элюент -
небольшую вязкость (уравнение (5) справедливо для коэффициента диффузии
