Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
частицами. Поры частиц заполнены неподвижным элюентом, и в них не
происходит транспорта б осиальном направлении колонки. Все растворенные в
элюенте соединения, включая не удерживаемые на колонке, диффундируют в
поры и из них и в результате отстают от фронта элюента. Обусловленное
этим процессом размывание зоны характеризует параметр С, или третий член
уравнения (1). На него оказывают влияние диаметр частиц, коэффициенты
диффузии растворенных соединений в подвижной фазе и объемная скорость.
При очень низких скоростях потока на размывание полосы влияет также
коэффициент продольной диффузии (параметр В в уравнении (24) гл. 1,
второй член в уравнении (4) данной главы). В жидкостной хроматографии
(ЖХ) его влиянием можно пренебречь, если, например, диаметр частиц равен
10 мкм, а линейная скорость превышает 2 мм/с. Величина коэффициента
продольной диффузии зависит от величины коэффи-
24 Глава 2
Рис. 2.2. Кривая Ван-Деемтера неподвижной фазы с частицами размером 5 н
10 мкм.
Неподвижная фаза: сферисорб SW; элюент: я-гегпан, 30-10"4% воды; проба:
C2CI4 (?=0), пирен (?=1,3).
циентов диффузии разделяемых соединений в подвижной фазе, а также от
вязкости элюента.
Очевидно, что эффективность колонки тем выше, чем меньше диаметр
частиц. Большинство стандартных колонок длиной 25-30 см заполнены
частицами диаметром 7-10 мкм, и число теоретических тарелок в них может
достигать (5-10) • 103 (по неудерживаемому компоненту). Если колонки
упакованы частицами меньшего диаметра (~5 мкм), то чтобы полностью
использовать разделительную способность колонки, необходимо добиться
минимально возможного влияния на уширение зон используемых приборов.
Дальнейшее уменьшение диаметра частиц (менее 5 мкм) дополнительно
увеличивает эффективность разделения, однако ограничивает ее
эксплуатационные возможности вследствие увеличения перепада давления,
нагревания за счет трения и т. д. ГП.12].
На рис. 2.2 в координатах уравнения Ван-Деемтера приведена
зависимость h от и для колонок, заполненных частицами диаметром 10 и 5
мкм. Минимальное значение h (оптимальная производительность колонки) -
функция диаметра частиц. Скорость, соответствующая оптимальному значению
h ("тщ при йтш), возрастает с уменьшением размера частиц [13]. Из рис.
2.2 следует также, что чем больше h и чем больше параметр С (наклон
восходящей ветви), тем больше время удерживания, что приводит к
дополнительному размыванию зон вследствие массопереноса.
Хроматографическая колонка 25
Этот эффект более ярко проявляется с увеличением коэффициента емкости
k. При заданной объемной скорости наибольшие значения h характеризуют
наиболее сильно удерживаемые соединения. Наклон восходящей ветви кривой
(рис. 2.2) увеличивается также с уменьшением коэффициентов диффузии
разделяемых веществ (при увеличении их молекулярной массы и (или)
вязкости элюента). В то же время значение umln уменьшается с увеличением
молекулярной массы. Поэтому при разделении высокомолекулярных соединений
при помощи эксклю-зионной хроматографии линейная скорость должна быть
небольшой.
Преимущества использования частиц малого диаметра более очевидны при
скоростях, превышающих Mmin- В этих условиях параметр С имеет значительно
меньшую величину как для неудерживаемых, так и в большей степени для
удерживаемых компонентов, что увеличивает эффективность разделения.
Поэтому, если необходимо уменьшить время разделения, целесообразно
использовать частицы наименьшего диаметра.
Иногда увеличение коэффициента емкости k сопровождается уменьшением Н.
В этом случае большую роль играет послеко-лоночное размывание пиков,
поскольку мертвый объем после-колоночного участка по порядку величины
равен объему пика. Поэтому оптимизация хроматографического разделения
должна предусматривать снижение внеколоночного мертвого объема.
Перепад давления, необходимый для достижения заданной скорости,
обратно пропорционален значению dp2, что ограничивает допустимое
уменьшение размера частиц, особенно для длинных колонок и (или) высоких
скоростей. Взаимосвязь давления и размера частиц описывает следующее
уравнение:
где В о - проницаемость колонки, см2; F- объемная скорость, мл/с; / -
длина колонки, см; г -радиус колонки, см; 14 -вязкость элюента, Па-с и АР
- перепад давления, Па. Для определения В0 необходимы лишь легко
поддающиеся измерению параметры. Зависимость В0 от диаметра частиц
описывается уравнением
где Т - коэффициент сопротивления колонки, лежащий в пределах от 500 до
1000 [15, 16].
Для того чтобы приведенные зависимости были более понятны, сравним
эффективности и скорости разделения на колонках, заполненных частицами
диаметром 10, 5 и 3 мкм. Типичные экспериментальные данные, полученные
для таких колонок, приведены в табл. 2.1. На колонке длиной 25 см,
заполненной частицами диаметром 10 мкм, можно получить ~ 10 000 тарелок.
B0 = Fr\l/nr2AP
(2)
B0 = dp2/'?
(3)
26 Глава 2
